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蛋白激酶Cα-胞外调节蛋白激酶1／2与人气道平滑肌细胞中周期蛋白D1及P21^cip1表达的关系被引量：3: 2008年; 目的探究蛋白激酶C（PKC）α-胞外调节蛋白激酶（ERK）1／2级联对支气管哮喘（简称哮喘）患者血清被动致敏的人气道平滑肌细胞（HASMC）周期蛋白D1（cyclinD1）、周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制剂P21^cip1的调节作用及细胞增殖的影响。方法用含10％哮喘患者血清的DMEM培养基被动致敏HASMC后，按随机数字表法分为对照组、12-肉豆蔻酰-13-乙酸佛波酯（PMA）处理组、PMA±PKCα错配寡核苷酸组、PMA±PKCα反义寡核苷酸组以及PMA±U0126组，每组4个样本。用Westernblot方法检测各组细胞磷酸化PKCα（p-PKCα）、ERK1／2、磷酸化ERK1／2（p-ERK1／2）、cyclinDl和P21eipI的蛋白表达水平，用流式细胞术和四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测HASMC增殖。结果PMA处理组p-PKCα水平、ERK1／2和p-ERKl／2蛋白水平高于对照组，cyclinD1、P21^rip1表达明显强于对照组（相对于各对照组的A值分别为2．10±0．29、1．67±0．19、2．20±0．27、1．99±0．22和3．11±0．29，均P〈0．05），HASMC的增殖[S期细胞比例为（30．3±2．4）％，A490值为0．80±0．06]高于对照组[S期细胞比例为（13．9±2．6）％，A490值为0．41±0．04]，均P〈0．05；PMA±PKCct反义寡核苷酸组中p-PKCot水平低于PMA处理组，ERK1／2和p-ERK1／2表达明显弱于PMA处理组，cyclinD1和P21cipl表达也明显低于PMA处理组（相对于各对照组的A值分别为1．23±0．19、1．34±0．18、1．52±0．20、1．45±0．18和1．49±0．18，均P〈0．05），HASMC的增殖显著下降[S期细胞比例为（21．2±2．8）％，A490值为0．51±0．04；g值分别为6．07，12．63；均P〈0．05]；同样与PMA处理组相比，PMA±U0126组中P-PKCα水平无明显改变（A值为1．99±0．18，g=0．94，P〉0．05），但ERK1／2、P—ERKI／2的表达，cyclinD1和P21^eip1的表达明显低于PMA处理组（A值分别为0．95±0．21、1．15±0．19、1．37±0．15和1．96±0．21，均P〈0�; 杜春玲徐永健刘先胜谢俊刚张珍祥张建乔礼芬倪望陈士新; 关键词：蛋白激酶CΑ 细胞外信号调节MAP激酶类细胞周期蛋白D1 肌细胞平滑肌

周期蛋白D1在香烟提取物促进支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用被引量：1: 2010年; 目的观察支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)周期蛋白D1(cyclinD1)的表达变化,探讨cyclinD1在香烟提取物(CSE)促进哮喘大鼠ASMCs增殖中所起的作用。方法 16只SD大鼠随机分为对照组(n=8)和哮喘组(n=8)。原代培养大鼠ASMCs,分为对照组(A组)、对照+CSE组(B组)、哮喘组(C组)、哮喘+CSE组(D组)、哮喘+CSE+pcDNA3.1组(E组)和哮喘+CSE+pcDNA3.1-ascyclinD1组(F组)。检测ASMCs增殖及cyclinD1 mR-NA、蛋白表达情况。结果 ASMCs增殖水平及cyclinD1 mRNA、蛋白表达水平比较,A组与C组,C组与D组,D组与F组间均有统计学差异(P均<0.01)。结论正常与哮喘大鼠ASMCs在CSE干预后增殖明显加快,cyclinD1表达明显增加。CSE可能是通过cyclinD1参与调控哮喘大鼠ASMCs的增殖。; 张晓宇马利军徐永健刘先胜张珍祥; 关键词：香烟提取物哮喘气道平滑肌细胞增殖周期蛋白D1

NF-κB参与哮喘血清被动致敏的人气道平滑肌细胞中PKCα诱导的CyclinD1上调及细胞增殖被引量：2: 2008年; 目的探究蛋白激酶Cα-核因子κB(PKCα-NF-κB)级联对哮喘血清被动致敏的人气道平滑肌细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的调节作用及细胞增殖的影响。方法用10%的哮喘患者血清被动致敏人气道平滑肌细胞(HASMCs),予以蛋白激酶C(PKC)激活剂12-肉豆蔻酰-13-乙酸佛波酯(PMA)刺激。分别以PΚCα反义寡核苷酸(PΚCα-asODN)和吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)抑制PKCα表达和NF-κB活化。用凝胶电泳迁移率改变试验(EMSA)检测HASMCs中NF-κB的活性,用RT-PCR法及Western blot法检测干预前后Cyclin D1的mRNA及蛋白表达水平,用流式细胞术和四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测HASMCs增殖。结果PMA刺激后磷酸化PKCα(p-PKCα)水平增高,NF-κB-DNA结合活性增强,Cyclin D1表达明显增强,HASMCs的增殖增强;而反义PKCα寡核苷酸转入细胞特异性地抑制PΚCα表达后,p-PKCα水平下降,NF-κB-DNA结合活性明显减弱,Cyclin D1表达也明显下降,HASMCs的增殖减弱(P<0.05,n=4);用PDTC抑制NF-κB活性后,PMA刺激下p-PΚCα水平仍然明显增高,但Cyclin D1的表达明显下降,HASMCs的增殖减弱(P<0.05,n=4)。结论NF-κB是PKCα的下游信号分子,PΚCα-NF-κB级联参与了PMA所诱导的哮喘血清被动致敏的人气道平滑肌细胞Cyclin D1的表达上调及细胞增殖。; 杜春玲徐永健刘先胜谢俊刚张珍祥张建乔礼芬倪望陈士新; 关键词：蛋白激酶CΑ 哮喘细胞增殖

Cigarette smoke extract promotes proliferation of airway smooth muscle cells in asthmatic rats via regulating cyclin D1 expression被引量：4: 2010年; Background Increased proliferation of airway smooth muscle cells （ASMCs） are observed in asthmatic patients and smoking can accelerate proliferation of ASMCs in asthma. To elucidate the molecular mechanisms leading to these changes, we studied in vitro the effect of cigarette smoke extract （CSE） on the proliferation of ASMCs and the expression of cyclin D1, an important regulatory protein implicated in cell cycle. Methods ASMCs cultured from 8 asthmatic Brown Norway rats were studied. Cells between passage 3 and 6 were used in the study and were divided into control group, pcDNA3.1 group, pcDNA3.1-antisense cyclin D1 （ascyclin D1） group, CSE group, CSE＋pcDNA3.1 group and CSE＋pcDNA3.1-ascyclin D1 group based on the conditions for intervention. The proliferation of ASMCs was examined with cell cycle analysis, MTT colorimetric assay and proliferating cell nuclear antigen （PCNA） immunocytochemical staining. The expression of cyclin D1 was detected by reverse transcriptase-PCR （RT-PCR） and Western blotting. Results （1） The percentage of S＋G2M phase, absorbance value at 490 nm wavelength （A490） and the expression rate of PCNA protein in CSE group were （31.22±1.17）%, 0.782±0.221, （90.2±7.0）% respectively, which were significantly increased compared with those of control group （18.36±1.02）%, 0.521±0.109, and （54.1±3.5）%, respectively）（P 〈0.01）. After the transfection with antisense cyclin D1 plasmid for 30 hours, the percentage of S＋G2M phase, A490 and the expression rate of PCNA protein in ASMCs were much lower than in untreated cells （P 〈0.01）. （2） The ratios of A490 of cyclin D1 mRNA in CSE group was 0.288±0.034, which was significantly increased compared with that of control group （0.158±0.006）（P 〈0.01）. After the transfection with antisense cyclin D1 plasmid for 30 hours, the ratios of A49o of cyclin D1 mRNA in ASMCs was much lower than in untreated cells （P 〈0.01）. （3） The ratios of A490 of cyclin D1 protein expressi; ZHANG Xiao-yuXU Yong-jianLIU Xian-shengZHANG Zhen-xiang; 关键词：ASTHMA PROLIFERATION

香烟提取物经级联反应促进支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖被引量：2: 2009年; 吸烟是影响支气管哮喘（简称哮喘）发生、发展的重要危险因素。香烟烟雾能增加卵清白蛋白（OVA）致敏豚鼠气道急性变应性炎症。我们既往的研究结果证实蛋白激酶C（PKC）信号通路在香烟提取物（CSE）促哮喘大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）的增殖过程中起重要作用。细胞周期蛋白（cyclin）D1是调节细胞周期G1期向S期转变的关键因子，但是目前尚不清楚PKC在参与CSE促哮喘大鼠ASMCs的增殖过程中是否涉及cyclinD1。; 张晓宇徐永健刘先胜张珍祥倪望陈仕新; 关键词：气道平滑肌细胞增殖支气管哮喘香烟提取物级联反应增殖过程

细胞周期蛋白D1对被动致敏的人气道平滑肌细胞增殖调控的影响被引量：1: 2008年; 支气管哮喘（以下简称哮喘）的本质是气道慢性炎症，并在此基础上出现气道高反应性和气道重塑；而气道平滑肌增殖在哮喘气道重塑中起重要作用，是不可逆性气流阻塞、持续气道高反应性的重要病理基础。细胞分裂增殖必须经过细胞周期有规律地运行，细胞周期蛋白对细胞周期运行起关键的调控作用。已有研究证实，在人气道平滑肌细胞（HASMC），细胞周期蛋白D1表达增加可促进细胞增殖，但有关细胞周期蛋白D1对哮喘HASMC增殖调控的研究目前少见报道。; 杜春玲徐永健刘先胜谢俊刚张珍祥张建乔礼芬倪望陈士新; 关键词：细胞周期蛋白D1 人气道平滑肌细胞细胞增殖调控被动致敏细胞分裂增殖

香烟提取物对支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖的影响被引量：6: 2009年; 目的:探讨香烟提取物(CSE)对支气管哮喘(简称哮喘)大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖作用及可能机制。方法:16只SD大鼠随机分为对照组和哮喘组,各8只。原代培养大鼠ASMCs,取第3-6代细胞,分为对照组、对照+CSE组、哮喘组、哮喘+CSE组、哮喘+CSE+嘧啶基-苯磺酰胺(GW8510,细胞周期蛋白依赖激酶-4抑制剂)组、哮喘+GW8510组。用流式细胞术、四甲基偶氮唑盐(MTT)法及增殖细胞核抗原(PCNA)免疫细胞化学技术检测ASMCs增殖;用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Westernblotting)检测细胞周期蛋白D1(cyclinD1)的表达。结果:(1)哮喘组ASMCs与对照组ASMCs相比,在S+G2/M期比例、吸光度(A)值和PCNA表达率上明显增高,差异显著(P<0.01)。(2)哮喘组ASMCsS+G2/M期比例、吸光度(A)值和PCNA表达率分别为(18.30±1.12)%、0.512±0.110、(55.1±3.7)%;哮喘+CSE组分别为(32.12±1.17)%、0.801±0.210、(90.2±7.3)%;哮喘+CSE+GW8510组分别为(17.21±0.95)%、0.508±0.009、(54.3±4.8)%;哮喘+GW8510组分别为(11.16±1.48)%、0.345±0.078、(40.6±5.4)%。除哮喘组、哮喘+CSE+GW8510组两组比较差异无显著外,其余两两比较差异均显著(P<0.01)。(3)哮喘组、哮喘+CSE组、哮喘+CSE+GW8510组、哮喘+GW8510组ASMCscyclinD1mRNAA值比值和蛋白表达A值比值分别为0.236±0.045、0.271±0.002;0.369±0.124、0.379±0.002;0.231±0.075、0.261±0.002;0.165±0.064、0.193±0.002。除哮喘组、哮喘+CSE+GW8510组两组比较差异无显著外,其余两两比较差异均显著(P<0.01)。结论:正常与哮喘大鼠ASMCs在CSE干预后增殖明显加快,cyclinD1表达明显增加。CSE可能是通过cyclinD1参与调控哮喘大鼠ASMCs的增殖。; 张晓宇徐永健刘先胜张珍祥倪望陈仕新; 关键词：香烟提取物哮喘气道平滑肌细胞细胞周期蛋白D1

香烟烟雾提取物对支气管哮喘患者血清致敏的人气道平滑肌细胞增殖的影响被引量：2: 2011年; 目的探讨香烟烟雾提取物（CSE）对支气管哮喘（简称哮喘）患者血清致敏的人气道平滑肌细胞（HASMC）增殖作用及其可能机制。方法原代培养HASMC，取第4～8代细胞，用10％哮喘患者血清致敏HASMC，分为血清组、血清＋CSE组、血清＋GW8510（嘧啶基一苯磺酰胺，细胞周期蛋白依赖激酶4抑制剂）组、血清＋CSE＋GW8510组，以10％非哮喘患者血清为对照组。用流式细胞术、四甲基偶氮唑盐（MTT）法及’H—TdR掺入法检测HASMC增殖，用逆转录．聚合酶链反应（RT-PCR）和Westernblot检测细胞周期蛋白D，（eyclinD，）的表达。结果血清组HASMC的S＋G：M期比例、吸光度（A）值和细胞DNA合成量[分别为（21．4±1．1）％、0．39±0．12和2669±138]明显高于对照组，差异均有统计学意义（g值分别为6．25、5．61、6．82，均P〈0．01）；血清＋CSE组HASMC的S＋G2M期比例、A值和DNA合成量分别为（33．3±1．3）％、0．61±0．20和3552±303，与血清组比较差异均有统计学意义（q值分别为5．67、6．32、5．56，均P〈0．01）；血清＋GW8510组HASMC的S＋G2M期比例、4值和DNA合成量分别为（14．7±1。4）％、0．30±0．10和1812±109，与血清组比较差异均有统计学意义（q值分别为6．02、5．53、5．79，均P〈0．01）。血清＋CSE组HASMCcyclinD，mRNAA值比和蛋白表达A值比分别为0．521±0．102和0．312±0．002，与血清组（分别为0．291-1-0．112和0．186±0．002）比较，差异均有统计学意义（q值分别为12．02和9．26，均P〈0．01）；血清＋GW8510组分别为0．223±0．038、0．150±0．002，与血清组比较差异均有统计学意义（q值分别为6．86、5．60，均P〈0．01）。结论CSE可能通过eyelinD参与调控哮喘患者血清致敏的HASMC增殖。; 张晓宇马利军徐永健刘先胜张珍祥; 关键词：哮喘肌细胞平滑肌

周期蛋白D1在蛋白激酶C调控哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用被引量：6: 2008年; 目的:观察蛋白激酶C(PKC)激活后哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)周期蛋白D1(cyclin D1)的表达变化及两者表达相关性,探讨cyclin D1在PKC调控哮喘大鼠ASMCs增殖中所起的作用。方法:卵清蛋白(OVA)吸入制备SD大鼠2周哮喘模型,原代培养ASMCs。采用正常大鼠(N组)和模型大鼠(A组)第3-6代细胞,分别应用PKC特异性激活剂12-肉豆蔻酰-13-乙酸佛波酯(PMA)及抑制剂Ro-31-8220干预ASMCs,根据不同处理分为4组:(1)空白组;(2)10nmol/L PMA组;(3)10nmol/L PMA+5μmol/L Ro-31-8220组;(4)5μmol/L Ro-31-8220组。采用流式细胞术,四甲基偶氮唑盐(MTT)法,增殖细胞核抗原(PCNA)染色等方法观察药物对ASMCs增殖的影响。RT-PCR方法检测PKC-α和cyclin D1 mRNA表达水平,Western blotting方法检测PKC-α和cyclin D1蛋白表达水平。线性相关分析评价PKC-α和cyclin D1表达水平的关系。结果:(1)在哮喘组,与空白对照比较,PMA组、Ro-31-8220组S+G2/M期比例、吸光度A值、PCNA阳性表达率,差异显著(P<0.01)。在正常组,与空白对照相比,PMA组、Ro-31-8220组S+G2/M期比例、吸光度A值、PCNA阳性表达率差异均显著(P<0.01)。(2)哮喘组内PMA组、Ro-31-8220组PKC-α以及cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平与空白对照比较,差异显著(P<0.01)。正常组和哮喘组变化趋势一致。(3)在mRNA水平,大鼠ASMCs PKC-α和cyclin D1的表达呈明显正相关(r=0.476,P<0.05),在蛋白水平两者的表达亦呈明显正相关(r=0.899,P<0.01)。结论:PKC-α能促进正常大鼠和哮喘大鼠ASMCs增殖,其在基因和蛋白的表达水平与cyclin D1的表达呈正相关,提示PKC-α可能通过调节cyclin D1而影响ASMCs的增殖。; 乔礼芬徐永健刘先胜谢俊刚杜春玲张建倪望陈仕新; 关键词：哮喘蛋白激酶C 细胞周期蛋白D1 气道平滑肌细胞

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国家自然科学基金(30670925)

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