湖南省自然科学基金(05JJ30178)
- 作品数：6 被引量：6H指数：1
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- 人sTNFR1基因原核表达及体外抗肝细胞凋亡的活性研究
- 2007年
- 采用RT-PCR,从Hela细胞的mRNA中扩增人sTNFR1基因,构建含有目的片段的T载体克隆及原核表达载体pMAL-c2x重组质粒亚克隆,转化入大肠杆菌,测序证实其序列与基因数据库中sTNFR1基因一致.经异丙基-β-D半乳糖苷酶(IPTG)诱导表达,淀粉树脂亲和层析法纯化,得到融合蛋白sTNFR1-MBP.结果显示:经Western-blotting检测,sTNFR1-MBP具有免疫活性L流式细胞术检测目的蛋白对TNF-α诱导QSG7701凋亡有抑制作用,这为今后的研究打下了基础.
- 彭仕芳傅蕾谭德明候周华刘洪波
- 关键词：原核表达
- 人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因的克隆、表达及鉴定被引量：1
- 2007年
- 【目的】构建人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因的重组质粒,进行原核表达。【方法】以Hela细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及原核表达载体pMAL-c2x重组质粒亚克隆,经异丙基--βD半乳糖苷酶(IPTG)诱导重组质粒菌表达sTNFR1,以淀粉树脂亲和层析法纯化重组蛋白,用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-blot-ting对重组蛋白进行分析鉴定。【结果】经核苷酸序列测序和Western-blot鉴定,成功构建了人sTNFR1重组质粒基因工程菌,表达了具有sTNFR1免疫活性的融合蛋白。【结论】构建了人sTNFR1重组质粒克隆,获得了具有sTNFR1的免疫活性的融合蛋白,为今后的研究打下了基础。
- 傅蕾彭仕芳谭德明侯周华
- 关键词：基因
- 人sTNFR1基因的克隆以及在NIH3T3细胞中的稳定表达
- 2007年
- 以Hela细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3.1(-)重组质粒亚克隆,将重组质粒和脂质体共同转染NIH3T3细胞系,G418筛选稳定转染细胞株.经核苷酸序列测序和酶切鉴定,成功构建了pcDNA3.1(-)-sTNFR1真核表达质粒,脂质体法建立了高效表达sTNFR1的稳定转染细胞系,并经RT-PCR和Western Blotting鉴定.人sTNFR1基因能在NIH3T3细胞系中稳定表达,为今后的研究打下了基础.
- 彭仕芳傅蕾谭德明刘洪波
- 关键词：真核表达稳定转染
- 人sTNFR1真核表达载体构建及体外抑制TNF-α细胞毒效应被引量：1
- 2007年
- 目的构建人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因(sTNFR1)的真核表达载体,研究sTNFR1对TNF-α细胞毒效应的抑制作用。方法以HeLa细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增人sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3.1(-)重组质粒亚克隆,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1(-)-sTNFR1瞬时转染QSG7701细胞,半定量PT-PCR法检测sTNFR1mRNA的表达,MTT法检测sTNFR1对TNF-α细胞毒效应的抑制作用。结果人sTNFR1基因被正确克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-);通过与3-磷酸甘油醛(GAPDH)比较,pcDNA3.1(-)-sTNFR1转染的QSG7701细胞中sTNFR1mRNA表达量明显高于空载体对照组和空细胞对照组(P<0.05);pcDNA3.1(-)-sTNFR1瞬时转染QSG7701细胞,TNF-α对其细胞毒性作用受到抑制,当TNF-α浓度为100μg/L时pcDNA3.1(-)-sTNFR1/QSG7701的细胞毒性较QSG7701下降64.8%。结论成功地构建真核表达质粒pcDNA3.1(-)-sTNFR1,TNF-α对瞬时转染pcDNA3.1(-)-sTNFR1/QSG7701的细胞株细胞毒性作用受到抑制。
- 傅蕾彭仕芳谭德明
- 关键词：真核表达瞬时转染细胞毒性作用
- 人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因转染对肿瘤坏死因子α诱导肝细胞凋亡的影响被引量：1
- 2007年
- TNFα能诱导肝细胞凋亡,其过度表达是肝衰竭发生发展过程中的一个重要因素。可溶性TNFα受体1（sTNFR1）可中和TNFα的部分毒性作用。为有效抑制TNFα诱导的细胞凋亡以及治疗肝衰竭,我们拟构建sTNFR1的真核表达载体,并将重组质粒pcDNA3-1（-）sTNFR 1瞬时转染QSG7701细胞,研究其对TNFα诱导细胞凋亡的抑制作用。
- 傅蕾谭德明彭仕芳侯周华
- 关键词：肝细胞细胞凋亡
- 人sTNFR1基因的克隆、融合表达与生物学活性被引量：3
- 2007年
- 采用RT-PCR,从Hela细胞的mRNA中扩增人sTNFR1基因,构建含有目的片段的T载体克隆及原核表达载体pMAL-c2x重组质粒亚克隆,转化入大肠杆菌,测序证实其序列与基因数据库中sTNFR1基因一致。经异丙基-β-D半乳糖苷酶(IPTG)诱导表达,淀粉树脂亲和层析法纯化,得到融合蛋白sTNFR1-MBP。结果显示:经Western-blotting检测,sTNFR1-MBP具有免疫活性;MTT检测目的蛋白可有效地封闭TNFα对QSG7701的细胞毒性作用;流式细胞术检测目的蛋白对TNF-α诱导QSG7701凋亡有抑制作用;sTNFR1-MBP具有良好的生物活性,为今后的研究打下了基础。
- 傅蕾彭仕芳谭德明刘洪波
- 关键词：克隆原核表达免疫活性生物学活性
