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定点突变提高γ-谷氨酰转肽酶的pH耐受性及催化活性被引量：4: 2016年; γ-谷氨酰转肽酶(GGT)是生物体内谷氨酰循环的关键酶,可广泛应用于多种γ-谷氨酰基化合物的生物合成。但其在体外催化环境下(p H>9.0)极易发生不可逆失活,限制其生物催化领域的实际应用。本实验以枯草芽孢杆菌B.subtilis NX-2 GGT(wt_GGT)为对象,采用同源建模获得wt_GGT的3D结构预测模型;分析wt_GGT大、小亚基表面氨基酸残基的性质、空间位置和保守性,最终选取Asp46、Thr201、Tyr280、Gln322、Glu502和His543为候选位点;通过定点突变将候选位点分别替换为缬氨酸,以期通过提高wt_GGT大小亚基间的疏水作用,改善其p H耐受性。研究成功实现了6种突变酶(D46V、T201V、Y280V、E502V、Q322V和H543V)的异源表达,并分别研究了其催化活性和稳定性。结果表明:D46V、Y280V、E502V、H543V的Km略小于wt_GGT,且Y280V的kcat较wt_GGT有明显提高;D46V、Y280V和E502V的p H稳定性均较wt_GGT有所改善,其中Y280V的p H稳定性最高;模型分析显示,在<10?范围内,Y280V可与附近4个氨基酸残基(Y-283、W-277、I-501和I-497)产生疏水相互作用,这可能是其p H耐受性较强的主要原因。; 彭清姚忠周治王浩绮肖环倪芳孙芸; 关键词：Γ-谷氨酰转肽酶定点突变疏水相互作用

两相体系中β-葡萄糖苷酶催化栀子苷水解制备京尼平被引量：8: 2014年; 京尼平是一种天然生物交联剂,且具有多种生理活性。本文以β-葡萄糖苷酶催化栀子苷水解制备京尼平为目标体系,证明了京尼平对β-D-葡萄糖苷酶具有竞争性抑制作用;考察了β-D-葡萄糖苷酶在不同有机相-水体系中的稳定性,发现其在正辛醇-水、正己醇-水体系中的稳定性均较好;测定了栀子苷在正辛醇-水和正己醇-水体系中的分配系数kD,gardenoside分别为0.17和0.76,而京尼平的分配系数kD,genipin为42.57和37.75;分别在水、正辛醇-水和正己醇-水体系中进行栀子苷水解制备京尼平的反应,当底物浓度为0.25μmol·ml-1时京尼平收率分别为89.17%、93.96%、90.16%;进一步提高底物浓度为2.0μmol·ml-1时,正辛醇-水体系中京尼平收率高达91.9%,较水相体系(79.7%)提高了12.2%。本文的研究结果证明了采用正辛醇-水两相反应体系可部分解除产物抑制,提高产物收率,并简化后续的产物分离。; 万丽花姚忠倪芳韦敏周治王浩绮孙芸仲兆祥; 关键词：栀子苷 Β-葡萄糖苷酶京尼平两相体系催化

载体两性电解质修饰对固定化γ-谷氨酰转肽酶pH耐受性和催化活性的影响被引量：3: 2016年; 针对γ-谷氨酰转肽酶（GGT）p H耐受性差的缺陷,首先以硅烷化改性的介孔氧化钛晶须（s MTw）为载体对重组枯草芽胞杆菌GGT进行固定化,再以p H 8.0-10.5的载体两性电解质Pharmalyte（CA,p H 8.0-10.5）对其进行后修饰,得到固定化酶s MTw-GGT-CA。结果发现：s MTw-GGT-CA的p H耐受性较游离酶明显提高,可在p H 6.0-11.0范围内保持稳定的催化活性。同时,s MTw-GGT-CA的热稳定性也较游离酶有所提高,其最适作用温度为50℃左右,热失活反应活化能Ed为49.88 k J/mol。s MTw-GGT-CA对γ-谷氨酰对硝基苯胺（Gp NA）的亲和力常数Km为0.579 mmol/L,与游离酶相近。; 韦敏姚忠叶丽静王浩绮倪芳周治仲兆祥孙芸; 关键词：Γ-谷氨酰转肽酶修饰 P 催化活性

大肠杆菌和枯草芽孢杆菌来源γ-谷氨酰转肽酶的克隆表达和性质比较被引量：4: 2014年; γ-谷氨酰转肽酶（GGT）是生物体内谷氨酰循环的关键酶,在生物有机合成领域具有重要的应用价值。今建立了大肠杆菌和枯草芽孢杆菌GGT的克隆、重组及诱导表达方法。在此基础上,分别考察了重组大肠杆菌GGT（rE_GGT）和重组枯草芽孢杆菌GGT（rB_GGT）的催化特性和稳定性。结果表明,rE_GGT对供体对硝基苯胺（GpNA）的亲和力（Km）优于rB_GGT,但rB_GGT的催化常数（kcat）高达3.48×105 s-1,是rE_GGT的20倍。稳定性研究表明,rE_GGT在pH 6-9和T〈45℃条件下的稳定性明显优于rB_GGT;但当温度超过45℃时,rB_GGT的稳定性更佳。通过对rE_GGT和rB_GGT的氨基酸组成及其大、小亚基界面相互作用力的分析表明,rE_GGT大小亚基间疏水键的数目明显多于rB_GGT,有助于稳定其四级结构,使其在中低温下具有良好的稳定性;而rB_GGT氨基酸组成中荷电残基和芳香族残基的比例较高,可有效维持其二级结构的稳定性。; 房鑫田思思姚忠王浩绮周治熊强孙芸韦萍; 关键词：Γ-谷氨酰转肽酶反应动力学稳定性

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江苏省自然科学基金(BK2012825)