国家自然科学基金(30800653)
- 作品数：2 被引量：0H指数：0
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- 小鼠核因子κB受体活化因子配基活性区的克隆、表达及生物活性分析
- 2010年
- 核因子κB受体活化因子配基是诱导破骨细胞分化、成熟的关键因子,在生物医学研究中应用广泛。本实验以小鼠的骨髓细胞cDNA为模板,采用PCR技术获得小鼠核因子κB受体活化因子配基活性区基因,并将该基因克隆至His标签的融合蛋白表达载体pET28a(+),经鉴定正确的质粒转化至BL21表达菌株中。通过调节诱导目的蛋白表达的培养温度、IPTG浓度及诱导时间,筛选出重组融合蛋白表达的最佳条件。将纯化后的重组蛋白稀释成不同浓度,刺激小鼠破骨前体细胞Raw264.7细胞分化,经抗酒石酸酸性磷酸酶染色后可见破骨细胞的形成,表明该重组蛋白具有较好的生物活性,可替代商品化的鼠源核因子κB受体活化因子配基。
- 翟春燕刘明耀罗剑
- 关键词：基因克隆原核表达破骨细胞分化
- 构建抑制NF-κB信号通路的药物筛选模型
- 2010年
- NF-κB已被证明在肿瘤和炎症过程中起到至关重要的作用。因此,建立抑制NF-κB信号通路的药物筛选模型至关重要。利用荧光素酶报告基因技术与蛋白印迹技术分别探索TNFα处理浓度及时间对NF-κB报告基因表达和NF-κB抑制亚单位IκBα降解的影响,进而构建NF-κB信号通路抑制剂药物筛选模型。实验结果表明,0.01 nmol/L TNFα作用24 h即能刺激HEK293T细胞中NF-κB报告基因较高水平的表达,且其表达量与TNFα的剂量和处理时间呈正相关性;0.01 nmol/L TNFα作用5 min即能使Panc-28细胞中IκBα明显降解,20min～30 min几乎降解完全,之后IκBα含量又开始增加。NF-κB阳性抑制剂藤黄酸验证表明NF-κB萤光素酶报告基因检测筛选体系和NF-κB抑制亚单位降解筛选体系两种体系稳定可行。结果证明,两种模型可以用于NF-κB信号通路抑制剂药物的筛选。
- 张立鹏李成海刘明耀罗剑
- 关键词：药物筛选模型TNFΑIKBΑ
