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红笛鲷主要组织相容性复合物Ⅰα抗原基因的克隆与表达分析被引量：4: 2012年; 为研究红笛鲷免疫防御相关基因的作用机理和调控机制,实验应用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)成功克隆了红笛鲷组织相容性复合物Ⅰα(MHCⅠα)抗原基因的全长cDNA序列,MHCⅠα的全长序列为1 369 bp,编码354个氨基酸残基。BLAST分析显示,红笛鲷MHCⅠα与其他已知物种MHCⅠα基因的最高同源性为84%。构建的系统进化树显示,红笛鲷MHCⅠα与石斑鱼等MHCⅠα亲缘关系较近。Real-time PCR分析表明,MHCⅠα在头肾中的最大表达量出现在哈氏弧菌ZJ0706诱导后6～15 h内;构建的重组表达质粒pET32a-MHCⅠα经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了正确表达。将纯化后的重组蛋白与佐剂混合后免疫新西兰纯种大白兔制备多克隆抗体。ELISA检测显示,所获得的兔抗血清效价约为1∶40 000。Western blot检测发现,本实验制备的抗血清能特异性地与重组蛋白发生抗原抗体反应。; 张新中鲁义善吴灶和简纪常; 关键词：红笛鲷原核表达

脂多糖、苯酚、硫酸铜对红笛鲷非特异性细胞毒性细胞受体基因表达的影响: 2012年; 应用Real-time PCR技术,研究脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、苯酚、硫酸铜刺激红笛鲷(Lutjanussanguineus)后非特异性细胞毒性细胞受体(NCCRP-1)基因在不同组织里的表达差异。结果发现,LPS刺激红笛鲷24 h后NCCRP-1在红笛鲷头肾、脾脏、胸腺、肝脏、心脏、脑、肌肉和肠组织中均有表达,其中头肾表达量最高,脾脏次之,然后依次是肝脏、脑、肌肉、胸腺和肠,心脏表达量最少。LPS、苯酚和CuSO4刺激红笛鲷后,随着刺激时间的增长,NCCRP-1表达量在各组织达到峰值的时间不同。以头肾为模式组织,RT-PCR的结果显示,红笛鲷NCCRP-1在LPS、苯酚和CuSO4的刺激下的表达模式相似,随着时间的增加NCCRP-1表达量逐渐增加,分别在24、9、12 h处达到最高,达到对照组的52、30、24倍左右,之后表达量开始下降。免疫组织化学表明,NCCRP-1只在头肾、脾脏和胸腺的特定细胞中表达。; 周晴简纪常鲁义善吴灶和; 关键词：红笛鲷基因表达脂多糖苯酚硫酸铜荧光定量PCR

红笛鲷重组激活基因rag1原核表达条件的优化及纯化被引量：3: 2012年; 克隆编码红笛鲷(Lutjanus sanguineus)RAG1蛋白(recombination activating protein1)活性核心区的基因序列,并与pET-28a(+)载体连接,构建原核表达载体pET-28a-RAG1,将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,利用IPTG进行诱导表达。为提高融合蛋白的表达效率,运用传统的实验方法对诱导条件进行优化。SDS-PAGE分析表明,在37℃条件下,利用0.1 mmol/L IPTG诱导8 h后,RAG1重组融合蛋白的表达量最大,相对分子质量与预测值相符,该蛋白主要以包涵体形式高效表达,利用His Trap HP亲和柱使其得到进一步纯化;Western blot分析显示,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性结合,说明表达蛋白为目的蛋白。; 张雪利鲁义善谢吉国简纪常吴灶和; 关键词：红笛鲷原核表达纯化 WESTERN BLOT分析

红笛鲷头肾消减cDNA文库的构建与分析被引量：5: 2011年; 应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建红笛鲷(Lutjanus sanguineus)头肾消减cDNA文库,筛选红笛鲷免疫相关基因的EST。以哈氏弧菌(Vibrio harveyi)灭活疫苗体内诱导红笛鲷为实验组,以注射无菌生理盐水的红笛鲷为驱动组,通过SSH技术构建红笛鲷头肾消减cDNA文库。利用PCR技术和斑点杂交对文库进行筛选,从2424个含插入片段的阳性克隆中筛选了680个克隆在上海生工进行了序列测定。使用BLASTx和BLASTn工具对获得的ESTs与GenBank数据库进行同源性比较并根据相似性序列的名称通过GO法对ESTs进行注释。结果获得了30个与红笛鲷免疫防御相关基因的EST,如组织相容性抗原复合物基因(MHCI和MHCⅡ)、免疫球蛋白基因(IgH和IgL)、热休克蛋白基因(HSP10、HSP70和HSP90)等。本研究构建了哈氏弧菌灭活疫苗免疫后与正常组织差异表达的消减cDNA文库,并获得一批与红笛鲷免疫防御相关的ESTs,旨在为探讨红笛鲷分子免疫防御机制、筛选参与免疫防御调控相关的功能基因,揭示红笛鲷免疫抗病机制、提高机体抗病力、实现遗传改良奠定基础。; 张新中吴灶和简纪常鲁义善; 关键词：红笛鲷抑制性消减杂交技术 CDNA文库免疫基因

红笛鲷NCCRP-1基因原核表达条件的优化及纯化被引量：6: 2010年; 通过克隆编码红笛鲷(Lutjanus sanguineus)非特异性毒性细胞受体蛋白-1(nonspecific cytotoxic cell receptor protein-1,NCCRP-1)成熟肽基因序列,然后与载体连接构建pET21a-NCCRP融合蛋白表达载体,将其转入大肠杆菌BL21进行诱导表达并优化条件。SDS-PAGE分析表明,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.8 mmol/L、37℃条件下培养3 h后表达量最大,分子大小与预期值相符,融合蛋白主要以包涵体形式高效表达,通过HisTrap HP柱子使其得到进一步纯化;Western blot分析表明,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性结合,说明获得该表达产物。; 魏世娜王蓓鲁义善吴灶和简纪常; 关键词：红笛鲷原核表达纯化

红笛鲷α-珠蛋白和β-珠蛋白基因的克隆及序列分析: 2011年; 应用已知的标签序列通过RACE-PCR和RT-PCR方法成功克隆红笛鲷（Lutjanus sanguineus）α-珠蛋白和β-珠蛋白基因的全长cDNA序列。α-珠蛋白和β-珠蛋白基因的cDNA全长分别为560和563 bp,开放阅读框分别为429和444 bp,各编码143和148个氨基酸,理论相对分子质量分别为15690和16400,理论等电点为7.79和6.61。氨基酸序列BLAST结果表明,红笛鲷α-珠蛋白基因和β-珠蛋白基因编码的氨基酸序列与其他鱼类的相似性分别在59%-79%和55%-80%之间。用邻接法（Neighbor-Joining）构建的α-珠蛋白基因和β-珠蛋白基因的系统发育树表明,红笛鲷与真鲷（Pagrus major）、金头鲷（Sparus aurata）和鰤（Seriola quinqueradiata）等亲缘关系较近。; 张新中鲁义善吴灶和简纪常; 关键词：红笛鲷 Α-珠蛋白 Β-珠蛋白基因序列

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国家自然科学基金(40906073)