海南省自然科学基金(809018)
- 作品数：6 被引量：25H指数：3
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- 相关机构：海南医学院解放军第187医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- 弓形虫ROP18基因原核表达载体的构建及表达被引量：10
- 2013年
- 目的采用PCR方法从刚地弓形虫RH株基因组DNA中扩增弓形虫ROP18基因,构建原核表达载体pET-ROP18,并检测融合蛋白ROP18的免疫反应原性。方法采用PCR技术扩增弓形虫ROP18基因,将其插入原核表达载体pET-28a中,构建原核表达质粒pET-ROP18,PCR和双酶切鉴定正确的重组质粒pET-ROP18转入大肠埃希菌BL21中,在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下表达融合蛋白,诱导产物裂解后进行SDS-PAGE电泳,观察重组蛋白的诱导表达情况,Western blot分析重组蛋白的反应原性。结果以弓形虫基因组DNA为模板,PCR扩增出约1.6kb的ROP18基因片段。将其定向插入原核表达载体pET-28a,构建原核表达质粒pET-ROP18,经PCR和双酶切鉴定后测序,显示重组质粒包含ROP18蛋白基因读码框内的完整序列,能完整表达ROP18抗原蛋白。重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达分子质量单位约63ku的融合蛋白,以37℃1mmol/L IPTG诱导4h表达量最大。Western blot分析重组蛋白能被鼠抗弓形虫血清识别。结论成功构建了原核表达载pET-ROP18,重组蛋白ROP18具有免疫反应原性。
- 赵焕阁韦祎黄用豪梁丽娟林映莹谭光宏
- 关键词：弓形虫原核表达
- 弓形虫MIC8基因的克隆及真核表达质粒的构建被引量：1
- 2011年
- 目的构建弓形虫微线体MIC8的真核表达重组质粒。方法设计合成弓形虫MIC8引物,运用PCR方法扩增其基因片段克隆至真核表达质粒pCDNA3.1,从而构建重组表达质粒pCDNA3.1-MIC8。结果 PCR扩增弓形虫MIC8基因序列正确,构建的重组表达质粒pCDNA3.1-MIC8经PCR、HindⅢ和XbaI双酶切和测序鉴定正确。结论成功获得真核表达重组质粒pCDNA3.1-MIC8,为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。
- 赵焕阁李煜谭光宏黄凤迎王华郭峻莉周松林黄用豪
- 关键词：弓形虫真核表达质粒
- 弓形虫MIC8基因对弓形虫病的免疫保护性研究被引量：1
- 2011年
- 目的观察弓形虫MIC8基因对弓形虫病免疫保护性的效果。方法用PCR方法扩增弓形虫MIC8基因,定向克隆到真核表达质粒pEGFP-N1中,构建重组表达载体pEGFP-MIC8;MIC8-EGFP转染293T细胞,荧光显微镜观察表达情况;然后分别用质粒pEGFP-MIC8、pEGFP-N1空载体及生理盐水肌肉注射免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,末次免疫3周后用弓形虫RH株速殖子感染免疫小鼠。结果 PCR扩增弓形虫MIC基因序列正确,构建的重组表达载体pEGFP-MIC8鉴定正确,荧光显微镜下观察到重组质粒能够在293T细胞中表达。弓形虫攻击感染后,质粒pEGFP-MIC8免疫小鼠与对照组相比,小鼠的存活时间有一定的延长。结论构建的真核表达重组质粒pEGFP-MIC8对抗击弓形虫攻击感染能够激发一定的免疫保护性。
- 赵焕阁谭光宏黄凤迎王华郭峻莉黄用豪
- 关键词：弓形虫免疫保护
- 弓形虫ROP5基因与基因佐剂IL-12对小鼠免疫保护性被引量：2
- 2013年
- 目的观察弓形虫ROP5基因疫苗和基因免疫佐剂IL-12共免疫对昆明小鼠所诱导的免疫保护性。方法大量制备重组质粒pcROP5和pcmIL-12,以100μg的剂量同时免疫昆明小鼠,PBS组和pcDNA3.1空质粒组作为对照。用ELISA法测定免疫鼠血清中特异性抗体IgG、IgG亚型的表达水平及细胞因子IFN-γ、IL-4的含量,MTT法测定淋巴细胞转化率,观察小鼠受攻击感染弓形虫后的存活时间。结果质粒pcROP5和pcmIL-12共免疫小鼠3次后,与pcROP5质粒单独免疫组和对照组相比,IL-12基因佐剂的共免疫提高了免疫鼠血清中特异性抗体IgG及IgG亚型IgG2a的表达水平,提高了细胞因子IFN-γ的含量,增加了淋巴细胞的转化率,但IgG1和IL-4的表达水平变化不大;攻击感染后,质粒pcROP5和pc-mIL-12共免疫组小鼠存活时间显著延长。结论弓形虫ROP5基因与基因佐剂pcmIL-12共免疫能增强对小鼠的免疫保护性。
- 赵焕阁林映莹黄用豪黄风迎周松林刘中娟谭光宏韦祎
- 关键词：DNA疫苗
- 弓形虫复合基因疫苗pcSAG1-ROP5诱导小鼠免疫应答的研究被引量：7
- 2013年
- 目的观察弓形虫复合基因疫苗pcSAGl-ROP5免疫小鼠后诱导的免疫应答。方法构建弓形虫重组真核表达质粒pcSAGl、pcROP5和pcSAGl-ROP5，分别通过PCR、酶切和测序鉴定后，转染人宫颈癌细胞（HeLa细胞），蛋白印迹（Westernblotting）分析重组蛋白的体外表达情况。70只昆明小鼠随机均分为5组（每组14只），分别为pc-SAGl组、pcROP5组、pcSAGl-ROP5组、空质粒组和空白对照组。重组质粒组每次每只肌注100μg重组质粒，每2周免疫1次，共3次。空质粒组和空白对照组分别注射等量的空质粒和PBS。于每次免疫前和末次免疫后2周眼眶采血。制备血清。采用ELISA法检测pcSAGl-ROP5组小鼠末次免疫后2周的血清与重组蛋白SAGl、ROP5和SAGl-ROP5结合的效价，以及5组小鼠的各次血清中抗弓形虫抗体IgG水平。末次免疫后3周，每组小鼠取10只腹腔接种10s弓形虫速殖子，观察生存时间。末次免疫后4周，采用ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清中r干扰素（IFN-r）和白细胞介素4（IL-4）的水平。结果重组真核表达质粒构建成功。Westernblotting分析结果显示，重组质粒pcSAGl、pcROP5和pcSAGl-ROP5均能在HeLa细胞中表达，重组蛋白的相对分子质量（尬）分别为31000、57000和88000。pcSAGl-ROP5组小鼠血清与重组蛋白SAGl、ROP5和SAGl-ROP5结合的效价分别为1：320、1：160和1：2560。3个重组质粒组小鼠血清抗弓形虫IgG抗体水平随着免疫次数的增加和时间的延长逐渐升高，末次免疫后2周，pcSAGl-ROP5组小鼠血清IgG抗体水平（0．612±0．031）显著高于其他各组（P〈0．05）。攻击感染后，pcSAGl-ROP5组小鼠的平均存活时间为（288±7）h，较pc—SAGl组和pcROP5组分别延长了48h和96h（P〈0．05）。末次免疫后4周，pcSAGl-ROP5组小鼠脾细胞培养上清中IFN-1水平[（908．52±6．31）pg／m1]显著高于其他各组（P〈0．05），各组的IL-4水平差异无统计学意义
- 赵焕阁范志刚黄风迎黄用豪周松林林映莹谭光宏
- 关键词：刚地弓形虫复合基因疫苗
- 弓形虫ROP5基因真核表达载体的构建及其免疫保护性的研究被引量：10
- 2012年
- 目的构建弓形虫pcDNA-ROP5真核表达载体,观察弓形虫ROP5基因在小鼠体内诱导的免疫反应。方法克隆弓形虫ROP5基因,将其插入真核表达载体pcDNA-3.1中构建重组质粒pcDNA-ROP5,脂质体法转染Hela细胞体外表达蛋白,蛋白质印迹(Western blotting)分析鉴定。将45只小鼠随机均分为3组,分别为PBS组、空质粒组、pcDNA3.1-ROP5组,每2w肌注免疫(100μg/只)1次,共3次,于免疫前及每次免疫前1d和末次免疫后2w收集小鼠血清,用间接ELISA法检测血清抗弓形虫的IgG。各组小鼠腹腔注射RH株弓形虫速殖子1 000个/每鼠,观察小鼠受攻击感染后的存活时间。结果真核表达载体构建成功,Western blotting分析结果显示,重组质粒pcDNA3.1-ROP5能在Hela细胞表达,蛋白相对分子质量为61kDa。pcDNA3.1-ROP5末次免疫后血清中IgG水平显著高于其他组,pcDNA-ROP5免疫的小鼠与对照组相比,实验组小鼠产生了明显的体液免疫应答。攻击感染试验中,实验组的小鼠比对照组的存活时间有明显延长。结论构建的真核表达重组质粒pcDNA-ROP5对抗击弓形虫攻击感染能够激发一定的免疫保护性。
- 赵焕阁王华黄用豪周松林郭峻莉黄凤迎林映莹谭光宏
- 关键词：弓形虫真核表达质粒免疫保护
