目的 观察HIV 1辅受体CCR5和CXCR4的配体在细胞内共表达抑制HIV 1感染的作用。方法 应用磷酸钙沉淀法共转染HIV 1辅受体及其配体的质粒 ,制成辅受体表型剔除的靶细胞 ,与转染HIV 1膜蛋白质粒的细胞混合 ,观察合胞体形成并记数 ;脂质体介导法将含有报告基因CAT而缺失HIV包膜蛋白的质粒与HIV包膜蛋白质粒共转染 2 93细胞 ,包装成具有一次感染活性的假病毒 ,感染转化pCMV R K S K、pCMV R K、pCMV S K或pCMV的PM 1细胞 ,采用同位素薄层层析分析法检测CAT活性。结果 pCMV R K S K转染可以显著抑制M及T嗜性HIV膜蛋白诱导的合胞体形成 ;CAT检测发现与pCMV转染组相比 ,当两种嗜性重组病毒感染pCMV R K S K转染组PM 1细胞时 ,仅检测到背景水平的CAT活性。结论 HIV 1辅受体CCR5 CXCR4表型剔除可以明显抑制M和T嗜性HIV
目的 观察HIV 1辅受体CCR5和CXCR4表型剔除对HIV 1DP1株感染的阻断作用。方法 用含有pLNCX R K S K的重组逆转录病毒液感染原代人PBLs(外周血淋巴细胞 ) ,抗体 免疫磁珠法分离筛选转化成功PBLs,流式细胞仪检测筛选效率 ;HIV 1DP1株攻击转化PBLs ,进行合胞体形成和p2 4抗原分泌检测。结果 抗 NGFR 免疫磁珠法获得了转化成功的PBLs ,流式细胞仪检测发现pLNCX R K S K转染组 77.4%的PBLsNGFR(神经生长因子受体 )标记物为阳性 ;HIV 1DP1株攻击后 ,未转染组和pLNCX转染组可以见到明显的合胞体形成 ,而在pLNCX R K S K转化PBLs没有见到合胞体形成 ;pLNCX R K S K转染组在感染后第 4、7和 10天皆可发现显著的p2 4抗原分泌抑制 ,抑制率分别为 15%、43 %、19%。结论 细胞内趋化因子通过与CCR5和CXCR4细胞内结合 ,使HIV 1两类主要辅受体难以在PBLs表面表达 ,从而可以达到阻断HIV
目的:构建HIV 1辅受体的配体-趋化因子RAN TES和SDF 1的逆转录病毒载体,并观察在NIH3T3细胞的表 达.方法:从重组质粒pCMV R K S K中获取RANTES KDEL SDF KDEL基因片段,构建RANTES和SDF 1的逆转录病毒 载体pLNCX R K S K,酶切鉴定并测序.采用标准的磷酸钙共 沉淀法转染包装细胞Bing,G418筛选克隆细胞,制备重组病 毒液,继之感染NIH3T3细胞,计算病毒滴度.间接免疫荧光 检测NIH3T3细胞中RANTES、SDF 1的表达.结果:pLNCX R K S K逆转录病毒载体酶切和测序结果与预期一致,筛选 出抗性克隆,制备了高滴度的重组病毒液,间接免疫荧光证实 RANTES和SDF 1可表达于转染细胞.结论:HIV 1辅受体的 配体、趋化因子RANTES和SDF 1的逆转录病毒载体构建成 功,重组病毒可以感染NIH3T3细胞,为下一步HIV 1感染实 验打下了基础.
目的 观察HIV 1辅受体的配体、趋化因子RANTES和SDF 1的双顺反子表达载体pCMV R K S K在HeLa细胞系表达 ,并对其抗HIV 1感染作用进行初步观察。方法 应用PCR扩增RANTES KDEL基因 ,鉴定后与真核表达质粒 pCMV S/K连接 ,构建RANTES和SDF 1双顺反子表达载体 pCMV R K S K ,酶切鉴定并测序。脂质体介导转染HeLa细胞 ,间接免疫荧光及放射免疫沉淀法检测RANTES和SDF 1表达。合胞体形成实验初步检测其抗HIV 1感染的作用。结果 酶切鉴定和测序证明成功构建了 pCMV R K S K双顺反子表达载体 ,间接免疫荧光及放射免疫沉淀法证实RANTES和SDF 1可以表达于HeLa细胞。pCMV R K S K转染能够抑制M和T嗜性HIV 1膜蛋白诱导的合胞体形成。结论 双顺反子表达载体 pCMV R K S K转染的HeLa细胞可以表达HIV 1辅受体的配体RANTES和SDF 1,并能抵抗HIV 1感染。
目的 观察Ⅰ型人免疫缺陷病毒 (HIV 1)辅受体的配体———RANTES和SDF 1α双表达于人淋巴细胞对各种嗜性HIV 1毒株感染的阻断作用。方法 用 pLNCX R K S K重组逆转录病毒液感染原代人外周血淋巴细胞 (PBLs) ,抗神经生长因子受体 (NGFR) 免疫磁珠法分离转化成功的PBLs,流式细胞仪检测筛选效率 ;HIV 1M嗜性、T嗜性和双嗜性毒株攻击转化PBLs ,检测HIV 1逆转录酶活性和 p2 4抗原分泌 ,以观察抗HIV 1感染的作用 ;同时进行转化PBLs表面CD3、CD4、CCR2、CCR5和CXCR4表达及破伤风毒素刺激后3 H 胸苷 (thymidine)掺入量检测 ,观察HIV 1辅受体配体的双表达对人PBLs正常生物学功能的影响。结果 抗 NGFR 免疫磁珠法获得了转化成功的PBLs,流式细胞仪检测发现pLNCX R K S K转染组 92 %以上的PBLs鼠抗NGFR标记物为阳性 ;HIV 1M嗜性、T嗜性和双嗜性毒株攻击后 ,pLNCX R K S K转化PBLs可以见到明显的逆转录酶活性和 p2 4抗原分泌抑制 ,并且在感染后第 12～ 2 0天时抑制作用最强 ;pLNCX R K S K转化PBLs表面CD3、CD4和CCR2表达水平无明显变化 ,而CCR5和CXCR4表达水平降低 ;破伤风毒素刺激后的转化PBLs仍具有主动增殖的能力。结论 HIV 1辅受体的配体通过在人PBLs内双表达 ,使HIV 1两类主要辅受体表型剔除 。
