国家自然科学基金(39970678)
- 作品数：16 被引量：56H指数：6
- 相关作者：严杰毛亚飞李淑萍李立伟阮萍更多>>
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- 问号钩端螺旋体rLTB/rCTB-LipL32/1免疫保护作用及野生株LipL32基因表达和患者抗体检测被引量：5
- 2005年
- 目的 构建LTB- LipL32/ 1和CTB- LipL32 / 1融合基因原核表达系统并鉴定其表达产物的免疫和佐剂活性及保护作用,了解问号钩端螺旋体(简称钩体)野生株LipL32基因携带、表达及钩体病人血清LipL32基因产物抗体产生频率。方法 采用常规分子生物学技术构建LTB- LipL32 / 1和CTB- LipL32 /1融合基因及其原核表达系统。采用SDS PAGE检测目的重组蛋白rLTB -LipL32 / 1及rCTB -LipL32 / 1表达情况。分别采用Westernblot和GM1 -ELISA检测rLTB -LipL32 / 1及rCTB -LipL32 /1的免疫反应性和佐剂活性。采用PCR和MAT分别检测97株问号钩体野生株LipL32基因及其表达情况。采用ELISA检测2 2 8例钩体病人血清LipL32基因产物的抗体。采用豚鼠保护试验检测重组蛋白的免疫保护作用。结果 与报道的相关序列比较,LTB -LipL32 /1和CTB- LipL32 / 1融合基因核苷酸序列相似性分别为99.12 %～99.71%和98.5 4 %～99.4 2 % ,氨基酸序列相似性分别为97.5 8%～99.6 3%和96 .77%～99.6 3%。rLTB- LipL32 1和rCTB- LipL32 /1表达产量均约为细菌总蛋白的10 % ,并主要以包涵体形式存在。rLTB -LipL32 / 1和rCTB- LipL32 /1均分别能与LipL32 /1兔抗血清和牛GM1结合。97.9%(95 97)问号钩体野生株含有LipL32基因,95 .9% (93 97)问?
- 阮萍严杰毛亚飞周晓辉
- 关键词：问号钩端螺旋体LTB基因霍乱弧菌
- rLTB/rCTB-rOmpL1/1的免疫原性和佐剂活性及问号钩端螺旋体野生株ompL1基因表达和病人血清特异抗体的检测
- 目的:构建ltB/ctB-ompL1/1融合基因及其原核表达系统,鉴定表达产物的免疫和佐剂活性,检测问号钩端螺旋体(简称钩体)野生株ompL1基因的携带、表达情况和钩体病人血清特异性抗体。方法:采用连接引物PCR 构建l...
- 阮萍严杰毛亚飞李淑萍罗依惠李立伟
- 关键词：基因表达
- 文献传递
- 问号钩端螺旋体 lipL32/1-lipL41/1融合基因原核表达系统的构建及野生株 lipL32、lipL41基因表达和病人血清特异抗体的检测
- 目的:构建问号钩端螺旋体(简称钩体)lipL32/1-lipL41/1融合基因及其原核表达系统,鉴定表达产物的免疫原性,了解钩体野生株lipaL32和lipL41基因携带和表达情况及钩体病人血清抗体水平。方法:采用连接引...
- 罗冬娇严杰毛亚飞李淑萍罗依惠李立伟
- 关键词：问号钩端螺旋体基因表达抗体
- 文献传递
- 问号钩端螺旋体血清群LipL41基因型分析及其表达产物的免疫学鉴定被引量：13
- 2004年
- 目的 确定我国 15群 15株问号钩端螺旋体 (简称钩体 )参考标准株和 2群 2株双曲钩体国际标准株携带LipL4 1基因情况 ,构建该基因的原核表达系统 ,鉴定表达产物的免疫原性。方法常规酚 氯仿法提取上述 17株钩体基因组DNA ,高保真PCR扩增全长LipL4 1基因片段 ,T A克隆后测序分型。构建LipL4 1基因原核表达系统 ,SDS PAGE检测重组目的蛋白 (rLipL4 1)表达情况。分别用钩体属特异性TR patocⅠ抗原、rLipL4 1兔抗血清的Westernblot鉴定其免疫反应性和抗原性。分别用显微镜凝集试验 (MAT)、钩体黏附J774A .1细胞模型检测兔抗rLipL4 1血清的交叉凝集效价和黏附阻断作用。结果 15株问号钩体均有LipL4 1基因 ,并可分为LipL4 1 1和LipL4 1 2两种基因型 ,2株双曲钩体则否。 11个LipL4 1 1基因和 4个LipL4 1 2基因克隆之间的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为88.6 1%～ 88.6 7%和 93.2 4 %～ 97.18%。所构建的原核表达系统rLipL4 1 1和rLipL4 1 2的表达量分别占钩体总蛋白的 30 %和 4 0 %。rLipL4 1 1和rLipL4 1 2均能与TR patocⅠ抗血清发生结合反应 ,免疫家兔能产生抗体。rLipL4 1 1和rLipL4 1 2兔抗血清对上述 15株问号钩体MAT效价为 1∶8～ 1∶12 8、1∶16～1∶2 5 6稀释时均能有效地阻断钩体对细胞的黏附。结?
- 丁威严杰毛亚飞
- 关键词：问号钩端螺旋体基因原核表达系统免疫学鉴定免疫反应性血清群
- 不同毒力钩端螺旋体属特异性外膜蛋白抗原的分析被引量：1
- 2004年
- 目的 了解不同毒力钩端螺旋体株有无属特异性外膜蛋白抗原。方法 TR/ patocⅠ钩体属特异性抗原免疫家兔获得抗血清 ,以显微镜凝集试验检测TR/patocⅠ属特异性抗原抗血清对我国 15群 17型问号钩体和 2群 2型双曲钩体的凝集情况。采用Auran介绍的方法制备问号钩体黄疸出血群赖型 5 6 6 0 1株、波摩那群波摩那型 5 6 6 0 8株和双曲钩体三宝垄群Patoc型patocⅠ株的外膜蛋白 ,用SDS -PAGE及Westernblot分析不同毒力钩体外膜蛋白的电泳特征及与TR/ patocⅠ属特异性抗血清的反应性。结果 钩体TR/ patocI属特异性抗血清能与上述各株钩体发生凝集反应 ,其效价为 1∶2 5 6～ 1∶5 12。三种不同毒力钩体外膜蛋白有相似的SDS -PAGE图谱 ,其主要蛋白组分的分子量约为 6 0kDa ,Westernblot结果证实在约31kDa处有一共同的能与TR/patocI属特异性抗血清发生反应的阳性条带。结论 钩体细胞表面具有属特异性抗原 ,分子量31KDa外膜蛋白可能是属特异性抗原之一。
- 罗依惠严杰
- 关键词：钩端螺旋体外膜蛋白抗原
- 钩端螺旋体主要属特异性蛋白抗原分布及其免疫性研究被引量：4
- 2006年
- 目的确定致病性问号钩端螺旋体(钩体)属特异性外膜蛋白的抗原性和交叉免疫反应性,为研制通用性钩体基因工程疫苗及检测试剂盒提供依据。方法采用Ni-NTA亲和层析法,提取了4种钩体外膜蛋白主要基因型重组表达产物rLipL21、rLipL32／1和rLipL32／2、rLipL41／1和rLipL41／2、rOmpL1／1和rOmpL1／2,并用SDS-PAGE检测表达及提纯效果。上述重组蛋白常规皮下免疫家兔获得抗血清,显微镜凝集试验(MAT)检测各抗血清交叉凝集效价。采用盐变法提取了我国15群问号钩体参考标准株及非致病的双曲钩体PatocⅠ株的外膜蛋白。以兔抗血清为一抗,采用Western blot检测上述4种外膜蛋白自然表达情况及其免疫反应性。结果rLipL21、rLipL32／1和rLipL32／2、rLipL41／1和r LipL41／2、rOmpL1／1和rOmpL1／2表达量分别约占细菌总蛋白的10％、40％和35％、15％和10％、30％和15％,各重组蛋白SDS-PAGE提纯后均仅见单一的蛋白条带。重组蛋白兔抗血清在同一基因不同基因型表达产物之间有广泛的交叉免疫反应性,与不同钩体血清群的MAT效价为1:2-1:128。各血清群钩体外膜中均可检出上述4种外膜蛋白,但LipL21仅存在于问号钩体中。结论LipL21、LipL32、LipL41、OmpL,1均为钩体属特异性表面抗原,可作为通用性钩体疫苗及检测试剂盒的候选抗原。
- 孙百莉罗冬娇孙军德严杰
- 关键词：问号钩端螺旋体外膜蛋白交叉凝集
- 问号钩端螺旋体属特异性OmpL1s抗原膜定位及其自然抗体应答被引量：5
- 2007年
- 为了确定问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性OmpL1s抗原膜定位及其自然抗体应答情况和抗体类型,为OmpL1s用于研制通用性钩体基因工程疫苗及检测试剂盒抗原提供依据。采用显微镜凝集试验(MAT)检测四川地区156份钩体病人血清标本。用PCR和核苷酸序列分析,了解中国流行的钩体主要血清群ompL1基因型。采用常规基因工程技术构建ompL1/1和ompL1/2主要基因型原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组表达产物rOmpL1/1和rOmpL1/2。采用胶体金免疫电镜技术,对OmpL1s进行膜定位。建立了基于rOmpL1s的ELISAs,检测钩体病人血清中特异性抗体水平及其类型。试验结果表明,黄疸出血群钩体仍然是四川地区最主要的优势钩体血清群。中国流行的钩体主要血清群ompL1基因可有ompL1/1和ompL1/2两个基因型,两者核苷酸和氨基酸序列相似性之间有较明显的差异。OmpL1s是位于钩体外膜表面的蛋白分子。不同稀释度的156例钩体病人血清标本中,rOmpL1/1和rOmpL1/2特异性IgM阳性率分别为67.9%～79.5%和75.0%～75.6%,特异性IgG阳性率分别为71.8%～79.5%和75.0%～76.9%。上述试验结果提示,OmpL1s是位于钩体表面属特异性蛋白抗原。自然感染钩体时,rOmpL1/1和rOmpL1/2均可诱导机体体液免疫应答并产生IgM和IgG两类血清抗体,且两者之间有广泛的抗原交叉反应。rOmpL1/1和rOmpL1/2可作为研制通用性钩体基因工程疫苗和检测试剂盒的候选抗原。
- 孙百莉郭宗琪罗冬娇孙军德严杰
- 关键词：问号钩端螺旋体分子定位
- 问号钩端螺旋体血清群LipL32基因型分析及其重组蛋白的免疫学鉴定被引量：18
- 2004年
- 目的 探讨 15群 15型问号钩端螺旋体 (简称钩体 )中国参考标准株及 2群 2型双曲钩体国际参考标准株是否均存在主要外膜蛋白 (MOMP)基因 (LipL32 ) ,克隆并构建该基因的原核表达系统 ,鉴定表达产物的免疫性。方法 常规酚 氯仿法提取上述钩体株基因组DNA ,高保真PCR扩增全长LipL32基因片段 ,T A克隆后测定核苷酸序列并构建表达系统 ,不同浓度IPTG诱导后用SDS PAGE检测rMOMP表达情况。分别用兔抗TR patocⅠ钩体全菌抗血清、rMOMPs免疫兔血清的Westernblot鉴定其免疫反应性和免疫原性 ,显微镜凝集试验 (MAT)检测rMOMPs免疫兔血清的交叉凝集效价 ,钩体细胞黏附模型检测抗体阻断效果。结果 上述 17株钩体均有LipL32基因 ,但可分LipL32 1和LipL32 2两种基因型。 13个LipL32 1和 4个Li pL32 2基因型之间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为 95 .12 %～ 96 .6 0 %和 97.79%～ 98.16 %。IPTG诱导后rMOMP1和rMOMP2表达量分别占细菌总蛋白的 4 0 %和 10 %。rMOMP1和rMOMP2均能与兔抗钩体TR patocⅠ血清发生结合反应 ,免疫家兔可对上述 17株钩体产生 1∶2～ 1∶6 4MAT效价的凝集抗体。 1∶2～ 1∶16稀释的兔抗rMOMP1和rMOMP2血清均能有效地阻断钩体的黏附。结论 所有检测的钩体具有LipL32 1或LipL32 2基因。
- 范兴丽严杰毛亚飞李立伟李淑萍
- 关键词：问号钩端螺旋体外膜蛋白免疫学鉴定
- 大肠杆菌LTB与霍乱弧菌CTB基因的克隆和表达及鉴定被引量：12
- 2003年
- 目的 :克隆大肠杆菌不耐热肠毒素 B亚单位 (L TB)及霍乱弧菌肠毒素 B亚单位 (CTB)基因 ,构建其表达载体。方法 :采用高保真 PCR分别从 E.coli4 4 815株与 V.cholerae东 74株基因组 DNA中扩增 L TB与 CTB基因 ,T- A克隆后测定核苷酸序列。分别构建 p ET32 a的 LTB及 CTB表达载体 ,在 E.coli BL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的 IPTG诱导表达。采用 SDS- PAGE及 GM1- EL ISA鉴定表达产物。结果 :所克隆的 LTB和 CTB基因与报道的相应核苷酸序列同源性分别为 99.12 %～ 99.71%和 98.5 4 %～ 99.4 2 % ,氨基酸序列同源性分别高达 97.5 8%～99.19%和 96.77%～ 99.19%。p ET32 a- L TB- BL2 1DE3和 p ET32 a- CTB- BL2 1DE3系统表达的融合蛋白产量分别占细菌总蛋白的 30 %和 10 %左右。GM1- EL ISA结果证实 LTB及 CTB融合蛋白均能与牛 GM1结合。结论 :本研究成功地构建了 LTB与 CTB表达系统 ,所表达的 L TB与 CTB融合蛋白具有粘膜免疫佐剂活性。
- 夏肖萍严杰钊守凤毛亚飞李淑萍
- 关键词：大肠杆菌LTB基因霍乱弧菌分子克隆免疫学
- 中国主要问号钩端螺旋体血清群外膜蛋白OmpL1的基因型,原核表达系统构建表达及免疫学鉴定被引量：15
- 2004年
- 目的 探讨 15群 15型问号钩端螺旋体 (简称钩体 )中国参考标准株及 2群 2型双曲钩体国际参考标准株是否均存在外膜蛋白OmpL1基因 ,克隆并构建该基因的原核表达系统 ,鉴定表达产物的免疫性。方法 常规酚 氯仿法提取上述钩体的基因组DNA ,高保真PCR扩增全长OmpL1基因片段 ,T A克隆后测定核苷酸序列并构建原核表达系统 ,不同浓度IPTG诱导后用SDS PAGE检测重组蛋白rOMPL1表达情况。分别用兔抗钩体TR PatocⅠ抗原、rOMPL1血清的Westernblot鉴定其免疫反应性和免疫原性。分别用显微镜凝集试验 (MAT)和钩体细胞黏附模型检测兔抗rOMPL1血清的交叉凝集效价和细胞黏附阻断作用。结果 上述 17株钩体均具有OmpL1基因 ,但至少可分 3种基因型 :OmpL1 1、OmpL1 2和OmpL1 3。与文献报道比较 ,所克隆的OmpL1 1、OmpL1 2和OmpL1 3基因核苷酸序列同源性分别为 93.87%～ 94 .0 8%、89.82 %～ 10 0 %和 80 .89%～ 81.72 % ,其氨基酸序列同源性分别为 93.13%～ 98.75 %、91.87%～ 10 0 %和 85 .6 3%～ 88.4 4 %。IPTG诱导后pET32a OmpL1 1 E .coliBL2 1DE3和pET32a OmpL1 2 E .coliBL2 1DE3的rOMPL1 1和rOMPL1 2表达量分别占细菌总蛋白的 30 %和 2 0 %。rOMPL1 1和rOMPL1 2均能与兔抗钩体TR PatocⅠ抗原血清发生免疫结合?
- 徐飏严杰毛亚飞李立伟李淑萍
- 关键词：问号钩端螺旋体基因型原核表达免疫学交叉凝集
