国家高技术研究发展计划(2012AA101501)
- 作品数：21 被引量：88H指数：6
- 相关作者：郑小波王源超曾丹丹张海峰叶文武更多>>
- 相关机构：南京农业大学中国林业科学研究院镇江市农业科学院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划公益性行业(农业)科研专项国家质检总局科技计划项目更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 逆转录环介导等温扩增技术快速检测大豆花叶病毒被引量：4
- 2014年
- 大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus，SMV）是一种在世界很多国家广泛分布并极具破坏性的植物病毒，导致大豆严重减产和种质衰退，每年都会给很多国家带来巨大的农业经济损失，为此，建立了一种逆转录环介导等温扩增（ Reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP）全新的SMV检测技术，利用该技术可以快速、准确与有效地检测大豆植株和种子中携带的SMV。根据GenBank数据库中大豆花叶病毒的外壳蛋白基因序列，设计并筛选到了SMV RT—LAMP特异性引物组，应用该引物组优化了RT—LAMP反应参数，灵敏度实验结果表明，RT-LAMP检测SMV比普通RT—PCR灵敏度高10～100倍。结合RNA粗提法，建立了一步法RT—LAMP快速、灵敏地检测到植物叶片中的SMV。加入荧光染料SYBR Green Ⅰ则可在反应管中直接观察检测结果，实现了检测的可视化。该RT-LAMP技术还可灵敏地检测到大豆种子中携带的SMV。RT-LAMP检测方法第一次应用于SMV的检测，具有灵敏度高、速度快和特异性强的优点，可应用于实验室和田间大豆样品SMV的快速检测。
- 张雯娜李晋玉田金艳卫其巍智海剑陶小荣
- 关键词：大豆花叶病毒大豆
- 基于环介导等温扩增技术检测瓜类细菌性果斑病菌被引量：3
- 2015年
- 本文利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),针对西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)基因组中Aave_4063和Aave_4064序列设计了2对特异引物Ac-F3/Ac-B3和Ac-FIP/Ac-BIP,建立了西瓜嗜酸菌的LAMP检测体系。利用该体系在65℃保温1h,通过荧光显色即可完成检测。设计的引物特异性强,其检测灵敏度为2.0×101 cfu/mL。该方法为西瓜嗜酸菌的检疫及其所致病害的快速诊断提供了新的技术。
- 赵玉强田艳丽罗金燕姚红梅余慧陈磊胡白石
- 关键词：环介导等温扩增技术瓜类细菌性果斑病菌
- 基于环介导等温扩增技术检测黄淮地区大豆主栽品种种子携带的病原菌被引量：11
- 2016年
- [目的]通过对黄淮地区大豆种子带菌的快速检测,了解该地区大豆种子携带病原菌的情况。[方法]采用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测黄淮地区29个大豆主栽品种种子上平头炭疽菌、胶孢炭疽菌、尖镰孢菌、木贼镰孢菌、层出镰孢菌、黄色镰孢菌、禾谷镰孢菌、茄腐镰孢菌、大豆拟茎点种腐病菌、立枯丝核菌、大豆炭腐病菌、冬青丽赤壳菌、大豆疫霉病菌等大豆主要病原菌的携带情况。[结果]供试的29个品种中有20个品种的种子样本检出携带上述病原菌,分别携带所检测的13种病原菌中的7种,检出率由高到低依次为平头炭疽菌、大豆拟茎点种腐病菌、木贼镰孢菌、黄色镰孢菌、尖镰孢菌、胶孢炭疽菌和层出镰孢菌,但不同大豆品种种子携带病原菌的种类及数量有较大差异,其中品种‘漯39001’检出的病原菌多达6种。[结论]本研究为大豆种子带菌检测提供了新的方法,并揭示了黄淮地区大豆种子携带病原菌的状况,在生产上有较大的应用价值。
- 曾丹丹张海峰田擎许苗王源超郑小波
- 关键词：大豆种子带菌环介导等温扩增技术
- 实时荧光定量PCR(SYBR Green I)检测不同抗枣疯病枣树品种嫁接接穗中的植原体浓度被引量：9
- 2015年
- 在枣疯植原体16S rDNA片段内设计并合成引物对DZ16SF-2/DZ16SR-2（扩增190 bp片段）,用重组质粒pMD18-DZ16S为模板建立标准曲线,并建立枣疯植原体实时荧光定量PCR（SYBR Green I）检测体系。溶解曲线分析显示：该引物特异性好,该体系对质粒模板的检测灵敏度达102 copies/μL。利用该体系对不同月份、不同发病级别的嫁接接种枣树接穗样品进行植原体含量测定。通过对高抗品种‘星光’,中抗品种‘黑腰子枣’、‘嘎嘎枣’和‘葫芦枣’,感病品种‘月光枣’、‘马牙枣’、‘莲蓬子’、‘北流西冬枣’和高感品种‘大红袍枣’嫁接到发病‘冬枣’砧木上所表现出的不同病级、病情指数和病原浓度比较结果发现,表现无症状的样品中植原体的含量在每克鲜重10^5～10^6个,发病Ⅰ～Ⅱ级枝条中植原体浓度在10^6～10^7个/g,Ⅲ～Ⅳ级发病枝条含量在10^7～10^8个/g鲜重,而V级发病枝条达到每克鲜重109个,表明接种发病的接穗症状严重度与其体内植原体浓度积累密切相关。高抗枣疯病‘星光’品种嫁接接穗体内病原浓度明显低于感病品种,而且有较多‘星光’接穗嫁接的发病砧木症状有所减轻,植原体浓度也有所降低。本研究可为探索枣树品种的抗病机制、抗病性鉴定及枣疯病植原体的防治提供参考。
- 任争光王合林彩丽刘曦宋传生冯术快于少帅卢绪利田国忠
- 关键词：枣疯病植原体抗病品种实时荧光定量PCR
- 应用环介导等温扩增技术检测江苏省水稻苗期与成株期的恶苗病病菌
- 2020年
- 为了解2018年江苏省田间水稻苗期和成株期的恶苗病病菌组成,应用可特异性识别藤仓镰孢、层出镰孢、拟轮枝镰孢和Fusarium andiyazi的环介导等温扩增技术检测疑似水稻恶苗病样本47份。结果表明,苗期与成株期检测到的恶苗病病菌组成不同,29份苗期样本中检测到藤仓镰孢、层出镰孢2种水稻恶苗病病菌的检出率分别为89.66%、27.59%;18份成株期样本中4种恶苗病菌均有检出,藤仓镰孢、拟轮枝镰孢、层出镰孢和F.andiyazi的检出率分别为88.89%、50.00%、27.78%、16.67%。结果表明,藤仓镰孢是江苏省水稻苗期与成株期恶苗病病原菌的优势种。
- 王晓莉李哲杨红福庄义庆
- 关键词：水稻恶苗病苗期成株期环介导等温扩增技术
- 基于杨生褐盘二孢菌2个专化型的ITS2二级结构特征分析被引量：2
- 2015年
- 【目的】杨生褐盘二孢菌在杨属的不同寄主上存在2个专化型,根据形态特征和现有的一些核酸分子序列标记上不易区分;本文在利用盘二孢属核糖体转录间隔区(ITS)序列构建的系统发育树基础上,结合ITS2区分2个专化型的特异性。【方法】对23株杨生褐盘二孢菌孢子形态特征观察。以基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到ITS序列。对从NCBI数据库中下载的盘二孢属的参考ITS序列,分别利用最大似然法、最大简约法和贝叶斯法构建3种系统发育树。同时,结合应用The ITS2 database预测ITS2二级结构模型,从分子进化角度分析杨生褐盘二孢菌2个专化型的特性。【结果】在寄主叶片上挑取的病原菌孢子形态比较典型,而在培养基上培养的孢子形态差异较大,不能依据传统的芽管萌发数有效区分2个专化型。3种ITS序列系统发育树可区分盘二孢属的3个种,但无法将参考ITS序列准确定位到专化型中。通过比较盘二孢属ITS2二级结构发现:蔷薇盘二孢菌和苹果盘二孢菌种内的菌株以及包括参考ITS序列在内的杨生褐盘二孢菌同一专化型的ITS2二级结构模型完全相同,但3个种之间及杨生褐盘二孢菌2专化型之间,ITS2二级结构上有多个位点的碱基差异。其中,杨生褐盘二孢菌白杨专化型的ITS2二级结构中螺旋Ⅰ上第17位碱基为A,螺旋Ⅱ上第43和44位碱基为AC,螺旋Ⅲ的CBC位点上配对碱基是第76和114位碱基C和G,hemi-CBC位点上是第75位碱基U;黑杨专化型的ITS2二级结构中螺旋Ⅰ上第17位碱基为U,螺旋Ⅱ上第43和44位碱基分别为G和U,螺旋Ⅲ上CBC位点上配对碱基分别是第76和114位的碱基U和A,hemi-CBC位点上是第75位碱基C。杨生褐盘二孢菌2个专化型在这些结构上存在碱基变异。【结论】基于ITS序列构建的3种系统发育树能将盘二孢属真菌在种间水平上进行区分,但不能在种内区分;通过ITS2二级结构的比较可发现,盘
- 孙晓明严东辉贺伟张星耀
- 关键词：专化型系统发育树
- 基于环介导等温扩增技术快速诊断由黄色镰孢菌引起的大豆镰孢根腐病
- 大豆镰孢根腐病是由多种镰孢菌引起的以导致根部和茎基部腐烂为主要症状的病害的通称。本研究基于环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以CYP51C为靶标...
- 曾丹丹田擎郑小波
- 文献传递
- 大豆茎褐腐病菌环介导等温扩增检测技术的建立被引量：2
- 2015年
- [目的]应用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立基于颜色判定的简便、快速和灵敏的大豆茎褐腐病菌[Phialophora gregata f.sp.sojae(PGS)]检测方法。[方法]利用LAMP技术,以ITS为靶序列,设计了4条特异性的LAMP引物和2条环引物,在此基础上建立了检测大豆茎褐腐病菌的LAMP体系。[结果]整个检测过程仅需1 h就可通过肉眼直接目测试验结果。在等温条件下(64℃)进行核酸扩增反应1 h,在扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,根据HNB的颜色变化可以判断PGS的存在与否。特异性试验中,大豆茎褐腐病菌菌株DNA扩增后HNB呈天蓝色的阳性反应,而在其他大豆常见病害的供试菌株中均呈紫色的阴性反应。在灵敏度试验中,ITS-LAMP技术最低检测限为10 pg·μL-1,对于进口大豆残体样本中PGS的检测灵敏度为每10 g大豆植株残体50个孢子。[结论]该方法的建立为检疫性病害大豆茎褐腐病菌的检测提供了新的技术平台,符合我国口岸对大豆茎褐腐病菌快速检测的迫切需要。
- 吴旭东陆辰晨沈浩吴翠萍张海峰王源超郑小波
- 关键词：环介导等温扩增ITS
- 利用环介导等温扩增技术检测黑白轮枝菌被引量：4
- 2016年
- [目的]黑白轮枝菌(Verticillium albo-atrum)能够危害苜蓿等多种作物,是我国重要的检疫性病原真菌。我们基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立基于颜色判定的简单、快速和灵敏的黑白轮枝菌检测方法。[方法]基于LAMP技术,通过比对分析黑白轮枝菌与其相似种不同靶标序列间的差异,选取Tub(β-tublin,编码β-微管蛋白)基因作为靶标基因,设计并筛选了4条特异性强、灵敏度高的LAMP引物和1条环引物,在此基础上建立了检测黑白轮枝菌的LAMP体系,并进行特异性、灵敏度试验及田间发病组织的检测。该方法在62℃等温条件下进行核酸扩增反应70 min,扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝),反应后根据染料颜色变化判定扩增结果。[结果]特异性试验中,仅黑白轮枝菌菌株DNA扩增后呈天蓝色的阳性反应,而在其他真菌的供试菌株中均呈紫色的阴性反应。该方法的最低检测限为1 pg·μL^(-1)。Tub-LAMP技术能够检测出发病苜蓿植物组织中的目标菌,在采自新疆的7份疑似样本中检测到3份阳性。在土壤中人工添加孢子的试验中,Tub-LAMP技术能够从每0.25 g土壤含有10个孢子和每10 g苜蓿种子含有50个孢子中检测出该病菌。[结论]该方法的建立为黑白轮枝菌的检疫及其所致病害的诊断提供了新的技术。
- 田擎曾丹丹李彬张海峰王源超郑小波
- 关键词：环介导等温扩增
- 基于环介导等温扩增技术检测橡树疫霉菌被引量：18
- 2013年
- 应用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了基于颜色判定的简单、快速和灵敏的橡树疫霉菌(Phytophthora ramorum)检测方法。以ITS为靶序列对橡树疫霉菌的分子检测存在无法区分近似种的问题,笔者在橡树疫霉菌的基因组研究中,发现了PrA3aPro类转座子序列。生物信息学分析表明,该序列非常适合作为大豆疫霉分子检测的靶标。利用LAMP技术,以PrA3aPro为靶序列,设计LAMP特异性引物,建立LAMP反应体系与条件,并进行灵敏度和特异性试验。结果表明:整个检测过程仅需1 h,即可通过肉眼直接目测试验结果。在等温条件下(64℃)进行核酸扩增反应1 h,然后经3种方法验证扩增结果:1)浊度仪验证浊度变化;2)琼脂糖凝胶电泳验证;3)在扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,根据HNB的颜色变化判定。特异性试验中,在橡树疫霉菌株中能够产生浊度曲线,扩增到梯形条带,同时HNB显色观察到天蓝色的阳性反应,而在其他疫霉、腐霉和真菌供试菌株中均没有观察到这些现象。在灵敏度试验中,PrA3aPro-LAMP技术最低检测限为1 ng.μL-1。该方法的建立为橡树疫霉菌的检疫及其所致病害的快速诊断提供了新的技术。
- 戴婷婷陆辰晨沈浩王源超郑小波
- 关键词：环介导等温扩增
