广东省科技计划工业攻关项目(2007A020903001)
- 作品数：5 被引量：40H指数：3
- 相关作者：孙国萍任随周许玫英张培培陈亮更多>>
- 相关机构：中国科学院广东省微生物研究所中国科学院研究生院更多>>
- 发文基金：广东省科技计划工业攻关项目国家自然科学基金广东省科学院优秀青年科技人才基金更多>>
- 相关领域：环境科学与工程生物学农业科学更多>>
- 乳糖替代IPTG诱导脱色酶TpmD基因在大肠杆菌中的高效表达被引量：21
- 2009年
- 本文考察了乳糖代替IPTG诱导三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的可行性,分别对用乳糖作为诱导剂时的诱导时机、乳糖浓度、诱导持续时间和添加方式进行优化并与IPTG诱导的差异等方面进行了比较分析,确定了乳糖诱导的最佳条件。结果表明,在工程菌对数生长中期(OD600约为0.8)添加终浓度为0.4mmol/L的乳糖诱导6h的条件下能获得最大量的目的蛋白和菌体量。由于乳糖可以作为碳源被菌体利用,分批添加乳糖效果优于一次性添加。乳糖诱导条件下目的蛋白表达量占总蛋白的35.62%,与IPTG诱导条件下的35.03%无明显差异。乳糖诱导后外源蛋白的表达时间有所滞后,但收获的菌体量高于IPTG诱导,显示出了乳糖同样是一种T7启动子的廉价高效诱导剂,可以代替昂贵的IPTG用于脱色酶TpmD的规模化发酵,同时也为其他重组蛋白的生产提供了有益的参考和借鉴。
- 陈亮任随周许玫英孙国萍
- 关键词：乳糖诱导IPTGT7启动子
- 三苯基甲烷类染料氧化酶基因(tpmD)在大肠杆菌中的无诱导表达被引量：2
- 2009年
- 为了解决嗜水气单胞菌DN322对鱼类的潜在致病性问题,有必要克隆表达该菌的三苯基甲烷染料脱色酶基因tpmD.通过PCR方法获得该基因,并与脱色希瓦氏菌S12的NAD(P)H脱氢酶基因启动子和用于荧光标记的编码CCPGCC的碱基序列融合,将有启动子和无启动子的融合基因片段分别连接到质粒pMD18-T中,转化大肠杆菌E.coliDH5α和E.coliBL21.结果发现,有启动子的融合基因能被E.coli在不加诱导物IPTG的条件下高效正确表达,脱色酶活性甚至超过基因供体菌DN322.将上述两株大肠杆菌工程菌株在自然水体中进行孔雀石绿污染小试处理,60d内在每个350mL反应体系中累积共投加大于10000mg的孔雀石绿,脱色率一直保持在92%以上;细菌数量最后增加了5～10倍.研究结果证明,基因工程菌在不加营养物的条件下也有很强的脱色活性和长期的存活能力;在tpmD基因3’端加入的用于螯合双砷荧光染料的18bp编码氨基酸碱基序列不影响此基因的表达和酶的脱色活性,这将赋予此工程菌可示踪性.
- 卫晋波孙国萍任随周岑英华王燕
- 脱色酶TpmD在大肠杆菌中的高效表达及纯化
- 2009年
- 用PCR方法从嗜水气单胞菌DN322基因组中扩增出编码三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD的基因,与表达载体pET-22b(+)连接构建成重组质粒pET22-tpmD,转化大肠杆菌BL21(DE3)得到重组工程菌株.结果表明,经IPTG诱导,脱色酶基因可高效表达,粗酶液降解结晶紫、孔雀石绿、碱性品红、灿烂绿的比活力达到569.5,386.9,516.1,273.0U/g.表达产物经Ni-NTA亲和层析法一步纯化,蛋白纯度达94.05%.对4种染料的比活力分别达到1075.3,1042.8,903.9,484.3U/g,重组质粒稳定存在于工程菌中,便于规模化发酵生产.
- 陈亮任随周张培培许玫英孙国萍
- 关键词：脱色酶纯化
- 微生物对三苯基甲烷类染料脱色的研究进展被引量：16
- 2009年
- 三苯基甲烷染料广泛应用于纺织印染、医药、生物染色、造纸、皮革、食品及化妆品等领域,常见的有作为抗菌剂的孔雀石绿和结晶紫等。由于其特殊的化学结构,在环境中较稳定且难以降解脱色,因此其生物脱色降解的研究可为印染废水处理和染料污染环境的生物修复提供理论依据。本文从细菌、放线菌、真菌及藻类等微生物对三苯基甲烷类染料降解脱色研究新进展做综述。通过分析不同微生物脱色三苯基甲烷类染料的中间产物来探讨其降解机理和降解途径,同时论及功能酶的分离纯化、酶学特性及其编码基因的克隆表达新进展,并分别从基础理论和应用两方面对微生物降解三苯基甲烷类染料未来的研究方向进行了展望。
- 张培培任随周许玫英孙国萍
- 关键词：微生物脱色降解
- 有机溶剂和抑制剂对毕赤酵母表达TpmD酶活性影响被引量：3
- 2009年
- 【目的】本文在利用毕赤酵母成功分泌表达高活性三苯基甲烷类染料降解酶TpmD的基础上,研究不同有机溶剂和常见酶抑制剂对纯化后的重组脱色酶TpmD活性的影响。【方法】将毕赤酵母分泌表达的重组酶TpmD经超滤浓缩及镍离子亲和层析柱纯化后得到纯化的重组TpmD酶。利用分光光度计法测定其对孔雀石绿脱色活性,并研究了各种有机溶剂和抑制剂对TpmD酶脱色活性的影响。通过脱色过程溶氧测定和全波长扫描分析反映了DTT与NADH作为TpmD辅因子时对孔雀石绿脱色反应的表观区别。【结果】甲醇对酶活性抑制作用较弱,重组酶在甲醇中能维持约90%的活性,乙醇和丙酮则使重组酶活性则迅速丧失。低浓度二甲基亚砜有利于重组酶活性的维持,30%的二甲基亚砜可抑制一半以上酶活性。L-半胱氨酸、叠氮化钠及低浓度的EDTA对重组酶活性影响较小,较高浓度的EDTA才显示较强抑制作用;表面活性剂SDS有强烈的抑制作用,极低的浓度也能完全抑制重组酶活性。抗氧化剂二硫苏糖醇(DTT)对重组脱色酶的作用十分独特,它可替代NADH辅助脱色反应并增加脱色速率,但在反应终点脱色总效率约为NADH作为辅酶时的92%。DTT辅助TpmD脱色孔雀石绿过程中的耗氧情况及脱色产物与NADH作为辅酶时明显不相同。【结论】发现不同有机溶剂和常见抑制剂对重组酶活性的影响存在较大差异,首次证实DTT能辅助TpmD脱色反应,这一脱色反应过程的作用机理与NADH为辅酶催化的反应原理完全不同。
- 张培培任随周许玫英孙国萍
- 关键词：有机溶剂抑制剂二硫苏糖醇
