浙江省科技计划项目(2010C34005)
- 作品数：4 被引量：2H指数：1
- 相关作者：方潇碧廖志苏张春鸿吴丽萍黄振校更多>>
- 相关机构：温州医学院附属第一医院首都医科大学更多>>
- 发文基金：浙江省科技计划项目温州市鹿城区科技计划项目温州市科技计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- Hsa-miR-15a/16-1靶向抑制Bcl-2基因对鼻咽癌CNE-2细胞的抑制作用被引量：2
- 2011年
- 目的观察Hsa-miR-15a/16-1靶向抑制B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cell lymphoma gene 2,Bcl-2gene)表达对鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)CNE-2细胞的生长抑制作用。方法将构建成功的重组质粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-15a/16-1经Lipofectamine 2000转染CNE-2细胞,RT-qPCR检测miR-15a/16-1、Bcl-2 mRNA表达水平,流式细胞术和WesternBlot检测Bcl-2、caspase-3蛋白表达水平,CCK-8法分析细胞生长抑制情况,4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色观察细胞凋亡状况。结果转染后miR-15a表达增高(F=547.525,P均<0.001);miR-16-1表达增高(F=99.979,P均<0.001);Bcl-2 mRNA表达无明显差别(F=0.220,P>0.05);Bcl-2蛋白表达下调,caspase-3蛋白表达增高;细胞在体外凋亡明显;细胞增殖受到抑制,作用呈明显的时效关系。结论 Hsa-miR-15a/16-1对Bcl-2基因的靶向抑制,可体外对CNE-2细胞产生增殖抑制和促进凋亡作用。
- 张春鸿方潇碧林森黄亚施清圆吴丽萍黄振校蒋磊谭映霞廖志苏
- 关键词：鼻咽肿瘤转染流式细胞术
- miR-15a/16-1慢病毒表达载体的构建及鉴定
- 2014年
- 目的:构建miR-15a/16-1过表达慢病毒载体,并对其进行病毒包装、鉴定、滴度测定与感染靶细胞。方法:利用PCR法钓取miR-15a/16-1序列片段;将目的基因miR-15a/16-1克隆到慢病毒载体LV3中,经双酶切及测序鉴定并大量抽提;利用脂质体将重组质粒和包装质粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G共转染293T细胞包装产生慢病毒。收集病毒悬液梯度稀释,感染293T细胞进行病毒滴度检测;将所得慢病毒感染靶细胞。结果:酶切与测序结果证明成功构建重组质粒,并成功包装成慢病毒,实验组病毒滴度为1×109 TU/ml,对照组病毒滴度为2×109 TU/ml。慢病毒成功感染靶细胞,其转染效率可达到80%左右。结论:成功构建miR-15a/16-1慢病毒表达载体,可获得高效miR-15a/16-1的慢病毒颗粒。
- 张春鸿方潇碧张露王珍珍武鹏廖志苏
- 关键词：慢病毒293T细胞绿色荧光蛋白
- 重组质粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a的构建与表达
- 2011年
- 目的:构建针对人鼻咽癌CNE-2Z细胞Bcl-2基因pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a真核表达质粒,转染至CNE-2Z细胞并检测其表达。方法:采用PCR法从重组质粒PGH-16-1/15a中获得16-1/15a-X2370G全长序列,在T4DNALigase连接酶作用下连接入重组载体pENTR-CMV-EGFP。重组质粒经酶切及测序鉴定。将构建成功的重组质粒转染入人鼻咽癌细胞株CNE-2Z,用荧光显微镜观察转染结果。结果:重组质粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a经酶切与测序证实构建成功,转染至鼻咽癌CNE-2Z细胞后,荧光显微镜观察证实该重组质粒能在CNE-2Z中表达。结论:成功构建真核表达质粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a,并在鼻咽癌CNE-2Z细胞中得到表达,可用于进一步检测其抗肿瘤机制。
- 方潇碧张春鸿黄亚林森黄振校吴丽萍施清圆李文峰廖志苏
- 关键词：质粒CNE-2Z
- 微小RNA-15a／16-1重组慢病毒对人鼻咽癌CNE-2Z细胞生物特性的影响
- 2013年
- 目的探讨微小RNA（microRNA，miR）-15a／16-1重组慢病毒对人鼻咽癌CNE-2Z细胞生物特性的影响，并探讨其可能机制。方法重组慢病毒和空载体慢病毒转染CNE一2Z细胞后筛选绿色荧光蛋白阳性细胞，实时定量PCR（RT-qPCR）检测miR-15a、miR-16-1表达水平；将实验分为对照组、转染组、放射线照射组、转染联合放射线照射组，四甲基偶氮唑蓝法分析各组细胞增殖情况；流式细胞术检测各组细胞凋亡情况；克隆形成实验分析对照组和转染组对放射线敏感性的变化；RT-qPCR、Westernblot法检测bel-2mRNA及其蛋白的表达水平；分光光度法检测Caspase-2、Caspase-3的活化程度。结果转染组miR-15a、miR-16-1相对表达量（x±s，下同）分别为524．80±40．79、466．11±40．96，同对照组比较，差异有统计学意义（t=494．611，f=386．840，P=0．000）；转染联合放射线照射组细胞增殖抑制最明显（F=424．255，P=0．000）。对照组、转染组、放射线照射组及转染联合放射线照射组的细胞凋亡率分别为（2．2±1．4）％、（9．64-0．8）％、（2．9±1．1）％、（18．6±0．7）％，差异有统计学意义（F=158．519，P=0．000）。转染组同等剂量下（2、4、6、8Gy）存活分数、平均致死剂量（meanlethaldose，Do）、准阈剂量（quasi-thresholddose，Dq）均低于对照组。二者放射增强比（sensitizationenhancementratios，SER）（Do）、SER（Dq）分别为1．473、1．581。转染组、放射线照射组、转染联合放射线照射组bcl-2mRNA表达相对量组间比较差异无统计学意义（P〉0．05）。转染联合放射线照射组bcl-2蛋白表达下降最明显，转染组次之；对照组、放射线照射组、转染组、转染联合放射线照射组的Caspase-2活化程度分别为0．12±0．01、0．24±0．04、0．35±0．02、0．44±0．04（F=115．500，P=0．000），Caspase-3的活化程度分别为0．13±0．01、0．27±0．0
- 张春鸿方潇碧李文峰施清圆吴丽萍陈晓云黄振校武鹏王珍珍廖志苏
- 关键词：原癌基因蛋白质C-BCL-2辐射耐受性微RNAS
