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苏禽黄鸡CVH基因真核表达载体构建及亚细胞定位被引量：2: 2014年; 本研究通过PCR技术克隆苏禽黄鸡CVH基因的CDS区,分别构建真核表达载体pcDNA3.1-CVH和pEGFP-C1-CVH,并用pcDNA3.1-CVH载体免疫小鼠制备多克隆抗体。pcDNA3.1-CVH和pEGFP-C1-CVH分别转染COS-7细胞,进行间接免疫荧光实验和CVH-EGFP融合蛋白亚细胞定位,并通过RT-PCR、Western blot进一步检测蛋白的表达。结果表明:克隆出CVH基因的完整CDS,构建了真核表达载体pcDNA3.1-CVH和pEGFP-C1-CVH,成功制备了多克隆抗体,转染后观察CVH基因表达产物定位于细胞质中,RT-PCR和Western bolt分别检测到1 989 bp特异条带和100 ku的融合蛋白。真核表达载体制备的多克隆抗体特异性良好,效价为1∶200,CVH基因蛋白在细胞质中表达,为进一步探讨CVH基因的生物学特性建立基础。; 朱睿张振韬左其生刘志永韦光辉李东连超张亚妮李碧春; 关键词：亚细胞定位 EGFP 间接免疫荧光黄鸡

CRISPR-Cas介导的基因编辑工具被引量：14: 2014年; 近年来,随着人们对CRISPR-Cas系统研究的不断深入和改造,CRISPR-Cas系统已成为一项新的基因靶向修饰技术,能够定向对靶基因进行定向沉默,目前该项技术已经成功地用于HEK293、小鼠及斑马鱼的细胞并产生了稳定的基因敲除细胞株,在小鼠、果蝇等模式动物上成功构建了基因敲除模型。CRISPR-Cas以其设计简单,耗时短、效率高等优点使其成为一项具有广阔应用前景的基因靶向敲除技术。就CRISPR-Cas的发现、结构、作用机理以及Cas9/gRNA目前的一些应用进行综述。; 左其生李东张亚妮李碧春; 关键词：基因修饰基因敲除

视黄酸及Stra8基因联合作用对雄性鸡胚胎干细胞分化的影响被引量：3: 2014年; 旨在研究视黄酸(All-trans retinoic acid,RA)及Stra8(Stimulated by retinoic acid gene 8)基因联合作用对雄性鸡胚胎干细胞(Chicken embryonic stem cells,cESCs)分化的影响。选用PCR方法鉴定雄性cESCs为研究对象,转染Stra 8基因,对Stra8基因阳性cESCs使用RA进行12d连续诱导,同时设立Stra8基因转染组、RA诱导组及空白组对照,各组均进行3次重复试验。细胞形态学、qRT-PCR检测RA及Sira8基因对cESCs分化的影响。结果表明。转染Stra8基因进行RA诱导,在诱导12d后,出现精原干细胞样的圆形小克隆,其他组cESCs出现类胚体或解体;qRT-PCR鉴定发现各组中干细胞标记基因表达量随着培养时间的延长逐渐下降,同时检测到生殖细胞相关基因表达,转染Stra8基因并使用RA诱导组中表达量均高于对照组(P<0.01),6d表达量达到最高,然后逐渐下降。Stra8基因和RA的联合作用能够促进cESCs向着生殖细胞方向的分化,不仅改变了原有细胞形态,同时出现了生殖相关基因的表达。通过该方法可以在体外建立一个。ESCs诱导分化模型,将为生殖细胞的发生、增殖、分化及调控机理的研究和人类不孕不育症的治疗奠定良好的基础。; 张振韬王丹施青青ELSAYED A K张亚妮韦光辉朱睿左其生李东刘堃李碧春; 关键词：RA 分化基因表达

pEGFP-hTERT转染鸡胚胎干细胞建系的研究: 2014年; 本研究旨在通过构建重组质粒pEGFP-hTERT转染鸡胚胎干细胞(Chicken embryonic stem cells,cESCs),优化鸡胚胎干细胞培养体系,以期构建鸡胚胎干细胞株或细胞系。在获得hTERT基因后,构建重组质粒pEGFPhTERT,并利用FuGENE^(?)HD转染鸡成纤维细胞(DF-1),转染24 h后,荧光显微镜检测;再以80%BRL-CM(大鼠肝细胞条件培养基)与20%的ES基础培养液混合的条件培养基培养分离的cES:s,添加10μmol·L^(-1)维生素C,AKP染色以及相关表面抗原SSEA-1、SOX2和OCT4检测鉴定后,以G418筛选pEGFP-hTERT转染的cES:s,传代培养后荧光定量PCR检测相关干性基因的表达水平。结果表明:维生素C可以促进cESCs增殖,pEGFP—hTERT转染的DF-1细胞中可以检测到绿色荧光表达,pEGFP—hTERT转染的cESCs可持续传至10代以上,且仍保持未分化状态,干细胞表面特异性抗原检测呈阳性,且相关干性基因的表达水平差异不显著(P>0.05)。综上表明:pEGFP-hTERT转染的cESCs在80%BRL-CM结合外源因子的作用下,能够持续稳定传至10代且仍保持未分化状态,可应用于鸡胚胎干细胞的永生化和细胞系建立。; 黄晓梅张蕾左其生施青青李东汤贝贝张亚妮宋九州李碧春; 关键词：HTERT基因鸡胚胎干细胞

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江苏省研究生培养创新工程项目(CXLX120934)