天津市自然科学基金(033605211)
- 作品数：3 被引量：9H指数：2
- 相关作者：俞新大赵娟何冰江汉民程秀玮更多>>
- 相关机构：南开大学天津现代职业技术学院更多>>
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- 人神经生长因子基因在大肠杆菌中的克隆、表达及产物纯化被引量：5
- 2006年
- 从人胎盘组织中提取总DNA,经PCR扩增编码人β神经生长因子(β-NGF)成熟肽的基因,并克隆到大肠杆菌表达载体pET15b中。重组质粒pET15b-NGF经测序与报道的完全一致。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导表达得到16kDa的目的蛋白带,与预期的大小一致,NGF表达量约占全菌总蛋白的25%。经过亲和层析柱(Ni2+-chargedIDAhis-bindcolumn)纯化后得到了单一的NGF蛋白条带,蛋白纯度可达90%以上,从每升表达菌液中可以得到4.56mgNGF。表达产物的Western印迹鉴定结果显示:重组人神经生长因子能与兔抗人β-NGF的多克隆抗体发生特异性结合反应,在16kDa处出现单一的条带,表明诱导表达的重组NGF具有免疫学活性。鸡胚背根神经节感觉神经元鉴定试验表明,表达的重组NGF具有良好的生物学活性。
- 赵娟何冰江汉民程秀玮俞新大
- 关键词：基因克隆纯化生物活性
- 神经生长因子基因的克隆及在昆虫细胞中的表达
- 2011年
- 以人胎盘组织DNA为模板,经PCR扩增出包含信号肽,前肽和成熟肽部分的prepro-NGF序列,经序列分析后克隆至转移载体pFastBac1中得到pFastBac-NGF,再将其转化含穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac,发生转座作用后,得到含NGF基因的重组穿梭载体rBacmid-NGF,用纯化的rBacmid-NGFDNA直接转染培养的昆虫细胞Sf9,得到重组病毒rAcV-Bac-hGH,经PCR和酶切鉴定,NGF基因正确地插入在病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下.表达产物经SDS-PAGE和Western blot检测在34 kD左右有一表达带并具有神经生长因子的免疫学活性.
- 程秀玮赵娟何冰江汉民俞新大
- 关键词：神经生长因子杆状病毒昆虫细胞基因表达
- ProNGF在大肠杆菌中的表达、纯化和复性被引量：4
- 2008年
- 将含有前导肽的人神经生长因子基因(proNGF)克隆在原核表达载体pET15b中,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导实现了目标融合蛋白的高效表达。SDS-PAGE分析表明表达蛋白占全菌总蛋白的20%左右,表达蛋白主要以包涵体的形式存在。用6mol/L的盐酸胍溶解包涵体后,通过Ni2+-NTA柱纯化,获得纯化的目标融合蛋白,电泳谱带扫描分析表明蛋白纯度可达90%以上。Western blotting检测显示,表达产物有较强的免疫学活性。经肠激酶作用后得到proNGF非融合蛋白,分子量为27kD,100mL表达菌液可获得13.1mg proNGF蛋白。用透析复性的方法将目的蛋白重折叠,复性率为18%,在重折叠过程中前导肽发挥了一定的积极作用。用PC12细胞进行生物活性鉴定,结果显示复性后的proNGF蛋白具有良好的生物活性。
- 江汉民柴新君何冰赵娟俞新大
- 关键词：神经生长因子前导肽蛋白复性生物活性
