国家高技术研究发展计划(2007AA021703)
- 作品数：10 被引量：4H指数：1
- 相关作者：张耀洲舒建洪陈新江陈剑清孟庆来更多>>
- 相关机构：浙江理工大学中国疾病预防控制中心中国农业科学院生物技术研究所更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金浙江省自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 家蚕DnaJ5基因的克隆与表达谱分析被引量：1
- 2009年
- DnaJ蛋白是一种调节蛋白。从构建的家蚕蛹cDNA文库中检索到一条编码DnaJ蛋白的EST,并克隆获得家蚕DnaJ5基因(Bm-DnaJ5,GenBank登录号为FJ592078)。该基因的开放阅读框长1 056 bp,编码351个氨基酸,分子质量为38.93 kD,等电点为9.25。利用实时定量PCR技术对Bm-DnaJ5基因在家蚕不同组织和发育时期的时空表达谱进行定量分析,结果显示:该基因在5龄幼虫时期的各组织中都有表达,在睾丸中的表达量最高,拷贝数达到1.16×108个/μg,其次在头部、中肠、前部丝腺和翅原基中的表达量也较高,在气管丛中的表达量最低,拷贝数仅为1.84×104个/μg;在蛹中期的几个组织中均有表达,其中在眼和睾丸中的表达量较高,拷贝数分别为8.79×107个/μg和1.78×107个/μg,而在卵巢中的表达量最低,拷贝数仅为1.94×105个/μg。
- 步翠玉宗志鹏李轶女张志芳张耀洲
- 关键词：家蚕克隆表达谱实时荧光定量PCR
- BmMP54基因在家蚕组织的表达模式及与BmNPV多角体蛋白基因的融合表达分析被引量：1
- 2017年
- 从家蚕蛹c DNA文库中筛选到一个403 bp的未知功能基因,将其命名为Bm MP54(Gen Bank登录号:DY231399.1)。该基因序列包含312 bp的开放阅读框,编码由103个氨基酸残基组成的蛋白质,生物信息学预测其含有2个跨膜区域,等电点及分子质量分别为9.90和10.463 k D。将Bm MP54与家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)的多角体蛋白基因(Polh)融合后分别连接到原核表达载体p GEX-4T-1和家蚕杆状病毒表达系统转移载体p Fast BacTMHTB中构建重组质粒,并分别在大肠埃希菌BL21(DE3)和家蚕卵巢培养细胞(Bm N)中表达。原核表达的融合蛋白通过调节p H值、阴离子交换层析等纯化获得了65 k D的重组融合蛋白Polh-Bm MP54,通过Western blotting可在重组杆状病毒感染的Bm N细胞中检测到42 k D左右的Bm MP54重组蛋白,表明已按设计要求高效表达并纯化获得目的蛋白质。实时荧光定量PCR分析显示Bm MP54在家蚕5龄幼虫的气门和脂肪体组织中表达量最高,在表皮和头部的表达量最低。上述研究结果有利于后续探讨Bm MP54在家蚕生长发育过程中的生物学功能。
- 严婷婷于滨潘海涛舒建洪张耀洲
- 关键词：跨膜蛋白表达谱
- 家蚕一个DDRGK超家族成员的克隆及分析
- 2010年
- DDRGK类蛋白是在动物及植物中发现的约有300个氨基酸残基的蛋白家族,含有一个高度保守的DDRGK基序,但功能还未知。在对家蚕幼虫cDNA文库的测序中发现了含有该保守结构域的EST序列,经过电子克隆、RT-PCR,获得该基因完整的cDNA序列,将其命名BmDDRGK(GenBank登录号FJ645927)。然后构建了重组质粒转化到大肠杆菌BL21和Rosetta中诱导表达,但经SDS-PAGE检测未检测到重组蛋白的表达。利用Real-timePCR技术对BmDDRGK在家蚕五龄幼虫期和蛹期不同组织的mRNA表达水平进行了鉴定。绝对定量结果显示BmDDRGK在家蚕五龄幼虫期和蛹期的各个组织中均有较为明显的表达,在五龄幼虫期,以中肠、马氏管、睾丸表达量较高,在蛹期,以翅原基、睾丸的表达量较高。
- 宗志鹏步翠玉张耀洲
- 关键词：家蚕克隆实时定量PCR
- 家蚕30kDa载脂蛋白19G1前体的生物信息学分析及克隆表达
- 2009年
- 从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中发现了一条编码低分子量30 kDa载脂蛋白19G1前体(lowmolecular mass 30 kDa lipoprotein 19G1 precursor)的EST序列(GeneBank登录号:AY568957),在NCBI数据库中比对后得知该基因的ORF长为771 bp,与基因组比对后发现该基因的ORF不含内含子,由单一外显子编码256个氨基酸残基的蛋白质,该蛋白属于家蚕30K蛋白家族,预测分子量约为29.5 kDa,等点电为7.29;信号肽分析显示该蛋白很可能存在信号肽。根据该基因ORF进行引物设计,以家蚕基因组为模板,PCR扩增获得该基因,将其克隆到pET-28a(+)载体中并导入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,裂解菌作SDS-PAGE分析,结果表明该蛋白前体成功表达,为研究其功能打下了基础。
- 陈晓平于威张耀洲
- 关键词：家蚕克隆生物信息学分析
- SHP-2蛋白NSH2结构域的原核表达和同位素标记
- 2010年
- SHP-2蛋白是一种含有两个SH2结构域的磷酸酶。SHP-2的N端SH2结构域是细胞因子或病毒因子激活该蛋白的分子内靶点。对shp2基因进行信息学分析,设计引物通过PCR克隆出人SHP-2蛋白N端SH2结构域(NSH2)的DNA序列。重组到原核表达载体pGEX-2T中,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功高效率表达了可溶性NSH2蛋白。对蛋白进行15N同位素标记和纯化,并浓缩获得达到进行核磁滴定法结构研究的蛋白样品。
- 牛皋郭江峰高晓莲张耀洲
- 关键词：SHP-2SH2结构域同位素标记HSQC
- 利用GST融合多肽制备人源膜受体多抗的研究
- 2010年
- 膜受体是一类膜蛋白,而全长的膜蛋白很难通过基因工程获得,这给制备该类蛋白的抗体增加了难度。为了探索一条制备膜受体多克隆抗体的新途径,通过基因重组技术,将膜受体的抗原决定簇与GST标签进行融合表达,然后免疫新西兰兔,获得了相应的多克隆抗体。结果表明,利用融合GST的多肽进行抗体制备的方法是可行的。
- 叶曼黄宏杰何靖陈剑清张耀洲
- 关键词：膜受体抗原决定簇抗体
- 人芳香基硫酸酯酶(HSulf-1)基因的原核表达及酶活初步研究
- 2011年
- 人芳香基硫酸酯酶(HSulf-1)是一类分泌型蛋白,能在中性条件下改变硫酸肝素蛋白聚糖(HSPGs)的硫酸化状态,从而影响多种信号分子与其相应受体的结合,进而影响细胞信号通路。鉴于HSulf-1具有重要的潜在应用价值,为获得大量纯化蛋白以探索其功能与应用,文章将HSulf-1功能域基因片段与pGEX-6p-1表达载体连接构建成重组质粒,在原核表达系统BL21中表达、分离纯化了HSulf-1的功能域片段,并以4-Mus为底物用荧光光度法进行了酶活性的测定。结果表明,原核表达能得到电泳纯级的HSulf-1纯化蛋白,但其具有酶活性的条件需要进一步探索。
- 马会彦陈钊李杰莫敏俐谢国良盛清
- 关键词：原核表达酶活性
- 马传染性贫血病毒膜蛋白基因的改造及其在真核细胞中的表达被引量：1
- 2008年
- 以马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)天然膜蛋白基因(gp120)为基础设计的DNA疫苗在马体内的表达量很低,这与密码子使用偏嗜性、RNA剪切位点多和导致RNA不稳定性的腺苷丰富区的大量存在有关。为解决这些问题,合成了EIAVgp120基因(Syn-env),使其密码子偏嗜性符合高水平表达的哺乳动物基因。EIAV弱毒疫苗的制备过程中,出现了几个重要而稳定的N-糖基突变位点,以Syn-env为基础,运用重叠延伸PCR定点突变策略获得了6个具有不同N-糖基缺失组合的gp120基因。将突变后的基因克隆到真核表达载体pVRCSV1.0,然后转染Hela细胞,发现这些重组质粒均获得了表达。进而为比较6种质粒诱导机体免疫保护效果,阐明EIAV弱毒疫苗减毒机理奠定了基础。
- 陈新江孟庆来毛洁张晓燕张耀洲
- 关键词：马传染性贫血病毒GP120定点突变真核表达
- 马传染性贫血病毒gp90蛋白的表达及其在诊断中的潜在应用
- 2009年
- 以质粒pVRCSV1.0-syn-gp90为模板,利用PCR扩增马传染性贫血病毒外膜蛋白基因(gp90),构建了原核表达质粒pET-28a(+)-gp90,然后转化大肠杆菌Rosetta(DE3),诱导表达并纯化该重组蛋白,ELISA和Western blot证明马的阳性血清可以识别该重组蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,测定的效价为1∶13,000。
- 陈新江毛洁孟庆来张晓燕张耀洲
- 关键词：GP90基因原核表达纯化EIAV
- 家蚕Bm595的表达、组织分布及亚细胞定位被引量：1
- 2010年
- 【目的】从家蚕蛹期cDNA文库中获得一条新基因Bm595,分析Bm595在家蚕体内的表达和定位情况。【方法】利用生物信息学分析Bm595序列,并构建重组表达质粒在大肠杆菌中诱导表达,以纯化的融合蛋白抗原,制备多克隆抗体。用荧光定量PCR和Western blot方法分析Bm595基因在家蚕各组织中的分布。用免疫细胞化学的方法研究Bm595蛋白的定位情况。【结果】Bm595在五龄幼虫的转录水平最高,卵中最低。Bm595在家蚕五龄幼虫各组织中的转录水平由高到低依次为:睾丸、丝腺、肠、头、卵巢、脂肪体、表皮、气管。在表达水平方面,睾丸的表达量最高,其次是丝腺和头,脂肪体有较明显的表达。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞化学试验,Bm595主要分布于细胞核内。【结论】在mRNA、蛋白质表达和细胞水平对Bm595进行初步表达分析和定位分析,为进一步研究该蛋白在家蚕中的功能提供重要依据。
- 王帅玉盛清吕正兵陈健聂作明王丹刘立丽沈红丹舒建洪陈剑清吴祥甫张耀洲
- 关键词：亚细胞定位
