国家自然科学基金(30270985)
- 作品数：11 被引量：33H指数：4
- 相关作者：冯书章刘军孙洋郭学军祝令伟更多>>
- 相关机构：军事医学科学院解放军军需大学吉林大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生生物学轻工技术与工程更多>>
- O157∶H7原噬菌体消除菌株的鉴定与分析被引量：2
- 2005年
- 目的 O15 7∶H7是一种重要的新发传染病病原 ,它主要引起出血性或非出血性腹泻 ,出血性结肠炎 (HC)或溶血性尿路综合征 (HUS)等。研究表明引起HC和HUS的主要毒力因子是由整合到O15 7基因组中的原噬菌体编码的志贺毒素(Stx) ,包括Stx1和Stx2 ,它们分别由原噬菌体 933v和 933w所编码。由于原噬菌体本身具有潜在的不稳定性 ,本研究以O15 7∶H786 - 2 4为始发菌株 ,将其进行传代培养 ,筛选原噬菌体消除菌株 ,对原噬菌体在O15 7基因组中的整合位点进行分析 ,并用Vero细胞对原噬菌体消除菌株的细胞毒性进行鉴定。结果筛选到了原噬菌体消除后的O15 7菌株 ,该菌株丧失了对Vero细胞的毒性作用。序列比较分析表明原噬菌体 933v的整合位点位于O15 7∶H7EDL933基因组中第 2 96 6 137位的相对位置 ,在整合位点两侧有一个 2 0bp的直接重复序列 ,原噬菌体 933w的整合位点位于基因组中第 1330 82 6位的相对位置 ,在整合位点两侧有一个 7bp的直接重复序列。该研究证实了编码Stx的原噬菌体具有不稳定性 ,原噬菌体对O15 7的致病性具有重要作用 ,也提示原噬菌体在致病菌的进化过程中也具有重要作用。
- 刘军冯书章孙洋郭学军常国权尹铁勇
- 关键词：O157:H7原噬菌体志贺毒素
- Stx1A-LHRH融合毒素基因的构建及高效表达
- 2010年
- 通过PCR方法,从肠出血性大肠杆菌O157:H7的基因组DNA中扩增出Stx1A基因序列,并将之与编码LHRH的基因序列连接起来,构建编码Stx1A-LHRH的重组融合基因片段,并定向克隆到表达质粒pET28a的NcoⅠ和EcoRⅠ位点之间,构建重组表达质粒pET28a::stx1A-LHRH,将重组质粒转化到宿主菌BL21(DE3)中。对重组菌株用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE电泳检测结果表明重组菌株表达出了23700的目的融合蛋白Stx1A-LHRH,目的蛋白为包涵体表达,经薄层扫描分析表明表达量约占菌体总蛋白的37.6%。为了将来更好的进行目的蛋白的功能研究,本研究再将融合基因片段克隆到表达质粒pMAL-p2x中实现了重组蛋白的可溶性表达,表达的重组蛋白经amylose亲和层析柱一步纯化后纯度可达93.4%,为下一步进行重组蛋白的活性分析及其生物学作用研究奠定了基础。
- 王文东刘军孙洋祝令伟郭学军周博冯书章
- 关键词：志贺毒素LHRH
- 大肠杆菌志贺毒素stxB融合基因的构建及其高效表达被引量：4
- 2005年
- 利用 PCR方法 ,从肠出血性大肠杆菌 O15 7∶ H7的基因组 DNA中 ,分别扩增出 Stx1B和 Stx2 B亚基的结构基因片段 ,然后再通过 PCR将这 2个片段连接起来 ,并定向克隆到表达质粒 p ET2 8a的 Nco 和 Eco R 位点之间 ,构建了重组表达质粒 p MB1。将重组质粒转化到宿主菌 BL2 1(DE3)中 ,对重组菌株 BL2 1(p MB1)用 IPTG进行诱导表达 ,并对最佳诱导时间进行了探索。 SDS- PAGE电泳检测结果表明 ,重组菌株表达出了 16 30 0的目的蛋白 Stx2 B- L-Stx1B;经薄层扫描分析表明 ,表达量约占菌体总蛋白的 6 8.4 % ,且目的蛋白为包涵体表达 ,表达量约占细菌沉淀的84 .6 %。研究还表明 ,未用 IPTG诱导的 BL2 1(p MB1)菌株也可有少量目的蛋白的基础表达。不同诱导时间的结果表明 ,在 3～ 7h的诱导时间内 。
- 刘军冯书章齐翀孙洋祝令伟郭学军尹铁勇庄永菊
- 关键词：MB蛋白S融合基因志贺毒素薄层扫描IPTG
- 出血性大肠杆菌O157菌壳的制备研究被引量：4
- 2010年
- 目的利用温度控制噬菌体PhiX174裂解基因E的表达,制备出血性大肠杆菌O157∶H7菌壳,鉴定其裂解效率并观察其形态。方法利用PCR技术扩增得到噬菌体PhiX174裂解基因E并克隆到质粒pBV220中,将重组质粒导入出血性大肠杆菌O157∶H7。重组菌株O157∶H7(pBV220::E)培养温度从28℃突升至42℃,每20min检测菌液OD600值,绘制重组菌株生长曲线。体外菌落计数计算裂解效率,并通过电镜观察菌壳结构。结果获得了PhiX174裂解基因E全长基因及重组质粒,构建了大肠杆菌的重组菌株。重组菌菌液OD600值在温度突升至42℃后40min后开始显著下降,80min后OD600值趋于平稳。细菌的裂解效率为98.4%。电子显微镜观察显示,经诱导后,O157∶H7细菌内容物可以通过细菌表面的孔道流出,从而形成菌壳。结论本研究成功制备了大肠杆菌O157∶H7菌壳,为将来进一步研究O157菌壳的特性奠定了基础。
- 刘爽刘军周博王文东李鹏祝令伟纪雪冯书章
- 关键词：出血性大肠杆菌
- 肠出血性大肠埃希菌O157疫苗研究进展被引量：2
- 2006年
- 肠出血性大肠埃希菌感染是重要的新发传染病,在世界范围内多次暴发流行。肠出血性大肠埃希菌O157能引起人的出血性结肠炎、溶血性尿路综合征和血栓性血小板紫癜等全身性并发症。控制该病暴发流行的最好措施是免疫预防,但目前还没有研制出可用于人的疫苗。该菌的主要毒力因子包括染色体上原噬菌体编码的志贺毒素、LEE致病岛编码的毒力相关蛋白及质粒编码的肠溶血素等。研制中的O157疫苗种类包括亚单位苗、基因工程减毒活菌苗、重组载体活菌苗和转基因植物疫苗等。近年来,随着基因组序列的解析及分子生物学技术的发展,针对大肠埃希菌O157免疫预防研究取得了重要进展。
- 孙洋冯书章
- 关键词：疫苗毒力
- 致病性大肠杆菌菌壳的研究
- 致病性大肠杆菌是一类重要的食物源性病原菌。对EPEC感染主要用抗生素进行治疗,但抗生素治疗会带来一些副作用。目前还没有预防EPEC感染的疫苗。菌壳是一种无胞质内容物的空壳状的无活性的细菌结构,完好地保留了细菌菌体和各种抗...
- 王文东刘军刘爽周博李鹏祝令伟纪雪冯书章
- 文献传递
- 出血性大肠杆菌O157基因缺失疫苗株的构建及其免疫被引量：3
- 2007年
- 出血性大肠杆菌O157感染是重要的新发食物源性传染病,主要致病特征之一是能引起人肠上皮细胞特征性的A/E损伤,A/E损伤主要是由LEE致病岛所编码的毒力因子所引起,ler是LEE致病岛毒力基因群的中心调节基因,对LEE致病岛所编码的毒力因子有正调控作用。O157:H7另一个毒力因子是由整合到染色体上的原噬菌体编码的Stx毒素。以O157:H786-24为始发菌株,利用自杀性质粒pCVD442和同源重组的原理构建了O157:H7的ler基因缺失突变菌株(缺失了ler基因中第73-351位的碱基,共279bp),并利用噬菌体消除技术筛选到消除了编码Stx的原噬菌体DNA的菌株,构建出了O157:H7ler/stx基因缺失突变弱毒菌株,并对该菌株的Vero细胞毒性、小鼠模型的安全性以及乳鼠的被动免疫保护作用进行了研究。结果表明,O157:H7ler/stx基因缺失突变菌株丧失了对Vero细胞的毒性作用,并丧失了对实验小鼠的致病性,具有良好的安全性。乳鼠被动免疫保护性实验表明,用该菌株免疫母鼠后,乳鼠通过吸吮母乳可以获得良好的被动免疫保护作用。因此本研究所构建的O157:H7ler/stx基因缺失突变弱毒菌株可作为预防EHEC O157:H7感染的疫苗候选株,为最终研究制出O157的基因工程菌苗奠定基础。
- 刘军孙洋冯书章
- 关键词：免疫接种弱毒疫苗
- 肠出血性大肠杆菌O157∶H7主要保护性抗原单克隆抗体的研制及特性分析被引量：10
- 2006年
- 以基因重组技术构建工程菌株表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7主要保护性抗原紧密素和志贺毒素的融合蛋白。融合蛋白采用凝胶分离电洗脱法回收纯化,用纯化的蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,细胞融合后获得的3株杂交瘤细胞株1G2、3C6、1B10,能分别稳定分泌针对紧密素、志贺毒素Stx1和Stx2的单克隆抗体。3株单抗分别制备腹水并纯化,ELISA检测效价分别为1∶6.4×105、1∶1.2×106、1∶3200。Western-blot检测表明,3株单抗与融合蛋白发生特异性反应。应用3株单抗均可特异性检出EHECO157∶H7,而3株单抗与其他不产生紧密素和志贺毒素的大肠杆菌不反应。
- 祝令伟冯书章刘军陈萍
- 关键词：肠出血性大肠杆菌O157:H7单克隆抗体志贺毒素
- 肠出血性大肠杆菌O157ler基因缺失突变株的构建及其特性被引量：2
- 2008年
- 以肠出血性大肠杆菌O157∶H786～24为始发菌株,利用自杀性载体pCVD442,根据同源重组的原理敲除了染色体上的ler基因,构建了O157∶H7 ler基因缺失突变菌株,并对其生物学特性进行了初步研究。荧光定量PCR试验结果表明,始发菌株对HEp-2细胞的平均黏附数量是突变菌株的17倍。试验也证实了ler基因对LEE致病岛毒力基因的正调控作用,这为O157∶H7基因缺失突变弱毒疫苗株的建立奠定了基础。
- 孙洋刘军郭学军张勇祝令伟周博冯书章
- 关键词：肠出血性大肠杆菌O157:H7缺失突变
- EHECO157∶H7stx基因缺失突变株的构建及其特性被引量：1
- 2005年
- 针对肠出血性大肠杆菌 (EHEC) O1 5 7∶H7的 stx基因 ,通过 PCR扩增出缺失了 1 83bp的 stx基因片段 ,将其克隆到自杀性载体 p CVD4 4 2中 ,然后通过接合性转导将重组自杀性质粒 p CVD4 4 2∷Δstx从大肠杆菌 SM1 0转到 O1 5 7∶ H7中 ,利用抗性标记和 PCR方法筛选出 O1 5 7∶ H7stx基因缺失突变菌株。Vero细胞毒性试验证实 ,该突变株不能产生完整的 Stx。动物试验表明 ,与强毒株相比该突变株的致病性明显降低。该突变株的构建为研究志贺毒素在 EHEC O1 5 7感染中所起的作用和研制 O1 5
- 孙洋刘军郭学军常国权尹铁勇冯书章
- 关键词：肠出血性大肠杆菌表型
