国家自然科学基金(30270988)
- 作品数：18 被引量：94H指数：5
- 相关作者：张彦明郭抗抗徐浩冶贵生张永国更多>>
- 相关机构：西北农林科技大学河南科技学院南京农业大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金陕西省自然科学基金国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生文化科学更多>>
- 逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒E2基因在真核细胞中表达及动物免疫试验初报被引量：3
- 2005年
- 利用DNA重组技术将猪瘟病毒(CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒表达载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明CSFVE2基因在SP2/0细胞膜上成功表达。将表达E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠,用流式细胞仪检测证明,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体。为下一步利用细胞免疫小鼠研制抗猪瘟病毒单克隆抗体打下基础。
- 许信刚胡建和张彦明
- 关键词：猪瘟病毒试验初报动物免疫真核细胞载体介导重组逆转录病毒载体
- 靶向猪瘟病毒NS3基因shRNA干扰载体的构建与鉴定被引量：3
- 2007年
- 利用RNA干扰在线生物学软件分析猪瘟病毒NS3基因,设计针对NS3基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列(其结构特征为正链(19nt)-环(9nt)-负链(19nt))。化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体中,构建重组载体pGene-NS3-1,pGene-NS3-2和pGene-NS3-3,转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对转化产物进行kan+筛选,碱裂解法提取重组质粒,将酶切鉴定为阳性的质粒测序。结果显示,双链干扰片段克隆方向正确,序列中未出现核苷酸的插入,缺失等突变现象。表明靶向猪瘟病毒NS3基因shRNA干扰载体构建成功。
- 冶贵生张彦明徐浩郭抗抗
- 关键词：猪瘟病毒RNA干扰
- 猪瘟病毒DNA疫苗的构建及动物免疫试验被引量：5
- 2005年
- 利用DNA重组技术将猪瘟病毒(CSFV)C株E2囊膜蛋白全长基因克隆到真核表达载体pcDNA4.0的CMV启动子下游,采用磷酸钙转染法将重组质粒转入293T细胞,流式细胞仪(FACS)检测293T细胞瞬时表达了E2囊膜蛋白。将构建的重组质粒肌肉注射BALB/c小鼠,用流式细胞仪和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测证明成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体,为下一步利用DNA疫苗免疫小鼠研制抗猪瘟病毒单克隆抗体打下基础。
- 许信刚胡建和张彦明
- 关键词：DNA疫苗抗E猪瘟病毒动物免疫囊膜蛋白
- 猪瘟病毒Shimen株p80基因的克隆及其真核表达质粒的构建被引量：3
- 2005年
- 根据已发表的猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)Alfort株和Brescia株的全基因组序列,设计2对引物P1/P2和B1/B2,在B1和B2的5'端分别加上XhoI和ApaI位点,以CSFVShimen株细胞毒为材料一步法提取总RNA,并以此为模板采用反转录PCR(RT-PCR)和套式PCR(nPCR),成功地扩增到约2.0kb的片段,将此PCR产物回收后与pMD18-T连接、转化,获得重组质粒,经PCR扩增,限制性酶切(BamhI/HindШ)和序列部分测定鉴定为阳性重组质粒P80-T。将P80-T分别经XhoI和ApaI酶切消化、回收后,与经XhoI/ApaI酶解的真核表达载体PEGPF-C1连接、转化,获得重组质粒,经PCR,XhoI和ApaI限制性酶切和序列测定鉴定为真核表达质粒P80-P,目的基因的插入位置、方向和读码框完全正确。为下一步在哺乳动物细胞中表达猪瘟病毒p80蛋白奠定了基础。
- 孙裴张彦明魏中锋倪斌洪海霞张永国郭抗抗王晶钰
- 关键词：真核表达质粒细胞毒套式PCR猪瘟病毒CSFV
- 三维子宫组织的构建及形态学观察被引量：1
- 2008年
- 本研究旨在体外构建含有3种细胞的三维子宫组织。体外成功分离和培养兔子宫内膜细胞和平滑肌细胞,将3代以内的平滑肌细胞以1×107/mL与3 mg/mLⅠ型鼠尾胶原和Matrigel(4∶1)的混合物混合,迅速接种在自制的模具中,置于37℃、体积分数5%CO2培养箱中待其凝固,以同样的方法接种1×107/mL子宫内膜基质细胞,待其凝固后接种上皮细胞悬液,将其置于37℃,体积分数5%CO2培养箱中培养。采用HE染色和免疫组织化学染色方法观察和鉴定三维子宫组织。结果表明,在体外成功地构建了含有3种细胞结构的类似于在体子宫组织的三维子宫组织;HE染色观察,在静态外力作用下,培养10 d的子宫组织细胞呈明显的按拉伸方向排列;细胞在细胞外基质中自由移动,上皮层呈弯曲状;免疫组织化学染色可以观察到具有3层细胞结构的子宫组织,弯曲的上皮层细胞呈柱状。可见子宫内膜细胞和平滑肌细胞能在细胞外基质中生长;建立了一套由3种细胞组成的类似于在体子宫组织结构的三维子宫培养体系;为胚胎植入机理的研究提供良好的体外模型。
- 陈秀荔赵永贞尹宝英张彦明
- 关键词：子宫内膜细胞平滑肌细胞胶原免疫组织化学染色
- 载体介导的shRNA抑制猪瘟病毒在PK-15细胞中增殖特性的研究被引量：7
- 2007年
- 利用生物学软件分析猪瘟病毒NS3基因,设计针对NS3基因不同位置的干扰序列,化学合成这些序列,然后退火连接为双链干扰片段,再定向克隆到干扰载体中,将酶切和序列测定鉴定正确的重组载体命名为pGene-NS3-1、pGene-NS3-2、pGene-NS3-3、pGene-NS3-Negative。重组干扰载体经纯化后转染PK-15细胞,并进行G418抗性筛选。克隆细胞扩大培养后,接种猪瘟病毒Shimen株,收集细胞分别进行实时定量PCR和ELISA光吸收度分析。Real-time PCR分析表明,与对照细胞比较,pGene-NS3-1、pGene-NS3-2、pGene-NS3-3转录产生的shRNA分子均在一定程度上沉默了病毒的基因,抑制率约为63%、46%、49%。ELISA检测结果表明,转染pGene-NS3-1、pGene-NS3-2、pGene-NS3-3重组载体的PK-15细胞均在不同程度上抑制了猪瘟病毒粒子的增殖。
- 冶贵生张彦明徐浩
- 关键词：猪瘟病毒RNAISHRNAPK-15细胞
- 多次传代和致细胞病变猪瘟病毒石门株E2基因序列分析被引量：4
- 2006年
- 根据已发表的猪瘟病毒基因组序列,设计合成了2对引物,以脾毒和细胞毒总RNA为模板,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、套式聚合酶链式反应(n PCR)及测序技术,对多次动物传代和致细胞病变的猪瘟病毒的主要外膜糖蛋白E 2基因的核苷酸序列进行了测定,用DNA star软件比较分析了E 2基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性。结果发现,脾毒和标准石门株的核苷酸序列同源性为99.4%,氨基酸序列同源性为99.0%,细胞毒标准石门株的核苷酸序列同源性为98.3%,氨基酸同源性96.7%。由此说明猪瘟病毒经猪多次传代和致细胞病变后均保持遗传的稳定性。
- 魏中锋张彦明孙裴张永国洪海霞倪斌郭抗抗王晶钰
- 关键词：猪瘟病毒E2基因
- 猪瘟病毒石门株NS3基因在大肠杆菌中的表达被引量：5
- 2007年
- 采用PCR技术,扩增了猪瘟病毒石门株NS3基因的丝氨酸蛋白酶、NTPase、RNA解螺旋酶活性功能区长度为2 000 bp的片段,将其克隆到pET-32a中,构建了原核表达载体pET-NS3,并将其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行了表达,同时对表达产物进行了SDS-PAGE和Western blotting检测。结果表明,IPTG诱导表达得到的pET-NS3融合蛋白的相对分子质量约为97 ku,与预期结果一致,且该重组蛋白能被CSFV阳性血清所识别。
- 鲁絮张彦明许信刚
- 关键词：猪瘟病毒大肠杆菌
- 猪瘟病毒石门株动物传代脾毒与组织培养细胞毒E2基因序列的分析
- 2005年
- 根据已发表的猪瘟病毒基因组序列,设计合成了2对引物,以脾毒和细胞毒总RNA为模板,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、套式聚合酶链式反应(nPCR)及测序技术,对多次动物传代和致细胞病变的猪瘟病毒主要囊膜糖蛋白E2基因的核苷酸序列进行了测定,用DNAstar软件比较分析了E2基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性。结果发现,脾毒和标准石门株核苷酸序列的同源性为99.4%,氨基酸序列的同源性为99.0%;细胞毒与标准石门株核苷酸序列的同源性为98.3%,氨基酸序列的同源性为96.7%。由此说明,猪瘟病毒经猪体多次传代和组织培养致细胞病变后,均能保持遗传的稳定性。
- 魏中锋张彦明孙裴张永国洪海霞倪斌郭抗抗
- 关键词：猪瘟病毒E2基因序列同源性
- 猪血管内皮细胞体外生长特性的研究被引量：4
- 2003年
- 试验以体外分离培养的猪血管内皮细胞为材料 ,研究了细胞的生长曲线、不同基础培养基对细胞生长的影响及胰岛素在生长液中的适宜含量。结果表明 ,传代猪血管内皮细胞接种后有1d左右的滞留期 ,然后细胞进入对数生长期 ,可持续 2d ,第 5d进入平台期 ,第 8d细胞开始脱落死亡 ;与MEM相比 ,M 199更适合于用作培养猪血管内皮细胞的基础培养基 ;在不用贴附基质和内皮细胞生长因子 (ECGF)的条件下 ,生长液中加入胰岛素 ,可明显促进细胞的生长和增殖 ,胰岛素的最适用量为 8μg/mL。
- 穆杨张彦明
- 关键词：血管内皮细胞基础培养基胰岛素
