国家自然科学基金(30572268)
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- 炭疽毒素PA在E．coli中的表达、纯化及其生物活性分析
- 2008年
- 目的:构建pET-32a(+)-PA重组质粒,实现融合蛋白Trx-PA在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中的表达,并获得有生物学活性的PA。方法:采用PCR的方法扩增PA的编码序列,并且与pET-32a(+)载体的Trx编码区融合产生pET-32a(+)-PA重组质粒,将重组质粒转化至感受态E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达pET-32a(+)-PA,通过SDS-PAGE和Western印迹进行分析。利用Ni2+金属亲和层析纯化表达产物,通过梯度透析进行复性。通过蛋白酶降解和细胞毒性实验分析Trx-PA的生物学活性。结果:成功构建pET-32a(+)-PA重组质粒,并纯化了Trx-PA融合蛋白。SDS-PAGE分析表明融合蛋白相对分子质量大小正确,经纯化复性后,蛋白纯度达到76%。Trx-PA在体内和体外均能被弗林蛋白酶(furin酶)降解。Trx-PA的正确降解是致死因子(lethal factor,LF)进入小鼠巨噬细胞Raw264.7内并产生细胞毒性的基础。结论:重组Trx-PA融合蛋白能在E.coliBL21(DE3)中有效表达,并表现出生物学活性。
- 李玉霞李伟东凌焱胡伟毛赟赟周围张京生梁龙陈惠鹏
- 关键词：炭疽毒素保护性抗原纯化
