教育部“新世纪优秀人才支持计划”(NCET-05-0774)
- 作品数：7 被引量：25H指数：4
- 相关作者：赵晓东赵耀张志勇窦颖杨锡强更多>>
- 相关机构：重庆医科大学中国农业科学院哈尔滨兽医研究所更多>>
- 发文基金：教育部“新世纪优秀人才支持计划”重庆市杰出青年科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 小鼠人偏肺病毒感染模型的建立被引量：4
- 2009年
- 目的建立人偏肺病毒（hMPV）感染小鼠模型，了解病毒肺内复制规律及所致病理改变，为hMPV感染免疫病理机制研究及新型防治手段开发奠定基础。方法BALB／c小鼠经滴鼻感染荧光标记的重组hMPV，于感染后1、3、5、7、9、16d处死小鼠并无菌获取肺组织用于病毒分离和病理检查，改良噬斑形成法检测hMPV滴度，RT—PCR法检测hMPVmRNA表达。结果小鼠滴鼻感染hMPV后肺组织分离到病毒；肺组织病毒滴度在感染后5d达到高峰（5．16±1．09）×10^5PFU／g，感染后第9天仍能检测到病毒（2．79±1．22）×10^2PFU／g；感染后16d肺组织仍可检测到hMPV mRNA；病理改变在感染后3～7d最明显，为典型的间质性肺炎改变。结论hMPV感染BALB／c小鼠模型建立成功，可用于hMPV感染的免疫病理机制研究。
- 窦颖赵耀张志勇赵晓东
- 关键词：人偏肺病毒BALB/C小鼠动物模型
- 人偏肺病毒检测方法的比较被引量：2
- 2010年
- 目的比较几种人偏肺病毒(hMPV)的检测方法,为临床选择适当的检测方法提供依据。方法不同稀释度的hMPV分别感染Vero-E6细胞,出现细胞病变(CPE)后,分别用RT-PCR、Real-time PCR和IFA进行检测,比较3种方法的灵敏度;10倍系列稀释滴度为105.2TCID50/ml的hMPV,分别用RT-PCR及Real-time PCR进行检测,定量比较两种方法的灵敏度;分别用Real-time PCR和IFA检测523份急性呼吸道感染患儿的鼻咽分泌物。结果IFA、RT-PCR和Real-time PCR分别可检出10-4、10-5、10-7稀释度孔中的病毒;RT-PCR和Real-time PCR检测的灵敏度分别为1.0×103和1TCID50/ml;在523份鼻咽分泌物标本中,IFA检测阳性率为9.18%,Real-time PCR检测阳性率为31.55%。结论Real-time PCR检测鼻咽分泌物标本中hMPV为儿科临床早期诊断的最佳方法;IFA可作为基层医院及hMPV相关严重呼吸道感染的检测方法。
- 任妍陈昕杜丽娜赵晓东
- 关键词：人偏肺病毒反转录聚合酶链反应实时荧光定量聚合酶链反应间接免疫荧光试验
- 人偏肺病毒感染人肺上皮细胞后Toll样受体的表达及其功能被引量：1
- 2009年
- 目的观察人偏肺病毒（human metapneumovirus）感染人肺上皮细胞后Toll样受体（TLR）表达变化及其信号通路的功能，探讨hMPV诱导气道炎症的部分机制。方法hMPV感染体外培养的人肺上皮细胞株A549，检测病毒在A549细胞中的生长曲线，并通过RT—PCR，real—time RT-PCR方法检测细胞TLR mRNA的表达，ELISA检测细胞培养上清IFN-α及TNF-α的表达。结果（1）hMPV可在A549细胞中复制，感染后3d达高峰10^5.2TCID50／ml。（2）RT—PCR结果提示：hMPV感染A549细胞6h后大部分TLR的表达均上调。（3）定量PCR结果提示：hMPV感染A549细胞后TLR3-4、TLR7-9的表达增高，且有时间依赖性，而紫外灭活的hMPV刺激细胞后TLR表达无明显变化。（4）ELISA结果提示hMPV感染后24h，IFN—α及TNF—α的表达均明显升高。结论人偏肺病毒感染A549细胞后可上调TLR表达，其诱导的炎性反应与部分TLR介导的信号转导途径有关。
- 窦颖赵晓东赵耀
- 关键词：人偏肺病毒TOLL样受体A549细胞IFN-Α
- 人偏肺病毒感染小鼠肺内Toll样受体表达及PolyI:C对病毒感染的影响被引量：1
- 2010年
- 探讨人偏肺病毒感染BALB/c小鼠后肺组织Toll样受体(TLRs)表达变化及PolyI:C对病毒复制的影响。实验小鼠分为hMPV感染组、polyI:C+hMPV组、polyI:C+DMEM组、DMEM对照组,均在滴鼻后1、3、5、7、9和16d处死,取肺组织用于病毒滴度测定、病理检查、通过RT-PCR和实时荧光定量PCR方法检测小鼠肺组织内TLRs mRNA的表达。结果显示:①与hMPV感染组相比,polyI:C+hMPV组小鼠肺内病毒复制水平明显减低,仅在感染后第5d及第7d检测到病毒;病理检查结果亦提示肺部炎症明显减轻。②RT-PCR结果提示:hMPV感染组小鼠与DMEM对照组相比,肺组织内大部分TLRs mRNA表达均升高。③实时荧光定量PCR结果提示:hMPV感染后小鼠肺组织TLR7-8 mRNA增高最为显著,且有时间依赖性;滴鼻后24h,polyI:C+hMPV组TLR3的表达明显升高。提示:人偏肺病毒感染BALB/c小鼠后,可上调小鼠肺组织Toll样受体表达,其中TLR7/8途径可能在启动天然免疫应答中起着重要作用;polyI:C可通过早期活化TLR3,抑制hMPV在小鼠肺内的复制,并减轻肺部炎症。
- 窦颖赵耀张志勇赵晓东
- 关键词：人偏肺病毒TOLL样受体BALB/C小鼠
- 绿色荧光蛋白标记重组人偏肺病毒的制备被引量：5
- 2009年
- 目的人偏肺病毒（human metapneumovirus，hMPV）可致人上、下呼吸道感染。研究利用反向遗传学技术，以带绿色荧光蛋白（GFP）标记的hMPV NL／1／00全长cDNA质粒及4种辅助质粒pCITE-N、pCITE—P、pCITE—M2．1和pCITE—L为基础，在体外制备GFP标记的重组hMPV病毒（命名为rhMPV NL／1／00GFP）。方法采用LipofeetAMINE2000将带GFP标记的hMPV NL／1／00全长cDNA质粒以及蛋白表达质粒pCITE—N、pCITE-P、pCITE—M2．1和pCITE—L共转染BSR—T7细胞，3d后取BSR—T7细胞上清液感染Vero—E6细胞，1～4d后观察Vero-E6细胞出现明显细胞病变（CPE）和绿色荧光，持续观察至第10天。收集病毒上清用于病毒滴度检测。提取培养上清的病毒RNA并通过RT—PCR方法扩增病毒N基因、F基因和G基因验证所获重组病毒。结果Vero—E6细胞接种1～4d后观察到明显CPE和绿色荧光，随后CPE加重，荧光信号加强，持续至感染后10d；第1、5、10、15和20代病毒的滴度波动于10^5.0～10^6.5 TCID50／ml；RT—PCR检测出符合预期大小的910bp（N）、450bp（F）和980bp（G）条带，经上述片段cDNA序列测定和比对表明获得的重组病毒与hMPV NL／1／00原型病毒序列一致。rhMPV NL／1／00GFP重组病毒在体外传代20代后，遗传信号和荧光信号均稳定。结论采用反向遗传学技术成功拯救了具有感染性的重组hMPV病毒，为hMPV感染发病机制及疫苗研究奠定了基础。
- 陈昕葛金英步志高赵晓东
- 关键词：反向遗传技术人偏肺病毒病毒拯救细胞病变效应绿色荧光蛋白
- X连锁多内分泌腺病肠病伴免疫失调综合征一例基因及蛋白表达研究被引量：10
- 2009年
- 目的探讨表现为顽固性腹泻、皮疹以及有或无胰岛素依赖性糖尿病的疑似X连锁多内分泌腺病肠病伴免疫失调综合征（IPEX）患儿FOXP3基因变异及其蛋白表达水平。方法对近两年来我院收治的4例表现为早发性顽固性腹泻、皮疹以及有或无胰岛素依赖性糖尿病的疑似IPEX男性患儿进行FOXP3基因扩增及测序分析，将发现的可疑突变位点通过数据库查询及与100例健康儿童相同位点序列比较，采用流式细胞仪检测CD4＋CD25＋FOXP3＋调节性T细胞比例和F0肼）3蛋白表达。结果4例疑似患儿中发现1例FOXP3突变，为11号外显子66位碱基错义突变（G〉A），导致FOXP3蛋白370位氨基酸由甲硫氨酸替换为异亮氨酸（Met370Ile），患儿母亲为携带者。100例正常儿童FOXP3基因相同位点未见变异，故可排除该位点多态性可能。该突变为此前未见报道的新突变，患儿CD4＋CD25＋FOXP3＋调节性T细胞比例升高而FOXP3表达量无减低。结论通过临床、免疫学筛查和基因分析，发现我国首例IPEX患儿（g：13128G〉Ac：1298G〉AMet370Ile），对早发胰岛素依赖性糖尿病、顽固性腹泻及不明肾脏损害婴幼儿，应考虑IPEX可能并进行FOXP3基因分析。
- 安云飞赵晓东许峰杨锡强
- 关键词：免疫缺陷综合征DNA突变分析T淋巴细胞调节性
- 先天性无丙种球蛋白血症μ重链基因突变一例被引量：6
- 2010年
- 目的探讨1例μ重链（μHC）基因缺陷患儿的临床特征和基因突变类型。方法患儿为男性，1岁10个月，临床诊断先天性无丙种球蛋白血症，BTK基因分析未见突变。采用PCR方法扩增患儿及父母μHC基因组DNA。采用RT-PCR扩增患儿μHCmRNA。PCR产物直接进行双向序列测定。结果患儿生后8个月开始反复出现发热、咳嗽。11个月出现右侧偏瘫，1岁零8个月出现左髋关节和右膝关节疼痛肿胀。脑脊液常规检查示细胞总数18×10^6／L[参考值（0～15）×10^6／L]，白细胞7×10^6／L[参考值（0～15）×10^6／L]，生化示蛋白0．14g／L（参考值0．15～0．45g／L），糖4．68mmol／L（参考值2．44～4．44mmol／L），氯化物116．3mmol／L（参考值120～132mmol／L）。头颅CT平扫未见明显异常。免疫球蛋白IgG181mg／L，IgA22mg／L，IgM28．8mg／L，IgE4．6U／ml。淋巴细胞分类示T淋巴细胞（CD3＋）67％，B淋巴细胞（CD19＋）为0，NK细胞（CD16＋ CD56＋）32％。基因分析患儿为μHC基因的复合杂合突变。一条等位基因在第4外显子剪接位点发生突变（1956G〉A），患儿父亲为此突变基因的携带者；一条等位基因在第1外显子核苷酸插入导致移码突变（170-175insert C，L11 fs 60X），患儿母亲为此突变基因的携带者。第1外显子插入突变为首次报道的突变类型。患儿μHC cDNA经半巢式PCR扩增并测序，发现第4外显子潜在剪接位点活化导致转录产物插入第4内含子136个核苷酸，导致仅合成分泌型μHC蛋白。结论通过临床筛查和基因分析，在我国首次报道μHC基因复合杂合突变（1956 G〉A和170—175insert C）患儿，并且发现1个第1外显子的新的突变位点。
- 张志勇赵晓东王墨张宇赵耀杨锡强
- 关键词：免疫缺陷综合征突变
