国家高技术研究发展计划(2007AA02Z142)
- 作品数：8 被引量：18H指数：3
- 相关作者：王一飞刘忠刘秋英张嘉萱王绍祥更多>>
- 相关机构：暨南大学河南省医学科学研究所北京师范大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 人TRAP1基因的克隆、原核表达及表达条件优化被引量：2
- 2011年
- 应用RT-PCR技术,从人白血病多药耐药细胞株K562/ADR中扩增出肿瘤坏死因子受体相关蛋白1(tumor nec-rosis factor receptor-associated protein1,TRAP1)基因的cDNA。选择NdeⅠ和XhoⅠ分别作为上下游引物的酶切位点,将TRAP1基因克隆到带有6×His标签的pET-28a(+)的载体上。重组质粒转化大肠杆菌DH5α中,涂布于含卡那霉素的LB琼脂培养基上,经双酶切鉴定后的阳性克隆送去测序。测序成功的重组质粒pET28a(+)-TRAP1转化大肠杆菌BL21(DE3)中,在IPTG的诱导下,成功表达重组蛋白TRAP1。通过改变诱导温度、诱导时机、IPTG浓度及诱导时间,找出最佳表达条件,使重组蛋白TRAP1表达量最高。结果表明,在39℃条件下,OD600达到0.8时,经终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导6 h,目的蛋白的表达量最高。该研究为纯化出TRAP1蛋白,进一步研究该蛋白的结构和功能奠定了基础。
- 张嘉萱卢嘉欣王蕊赵振岭韩波彭鑫磊陈伟刘忠任哲王绍祥马岩岩刘凯胜王一飞
- 关键词：克隆原核表达BL21
- Nm23-H1基因沉默后K562细胞中肿瘤相关基因的差异表达
- 2010年
- 目的:应用基因芯片技术,检测nm23-H1基因沉默后K562细胞中与肿瘤相关基因的差异表达情况,探讨nm23-H1基因沉默对K562细胞生物学行为变化的分子作用机制。方法:采用Trizol一步法抽提K562-siNM23细胞和K562-siNC细胞总RNA;用RNA扩增试剂盒进行双链cDNA的合成及荧光标记cRNA的合成,并纯化cRNA。与功能分类基因芯片杂交反应后,用计算机分析比较2种细胞中与肿瘤相关基因的差异性表达。结果:共筛选出表达差异性基因14个,其中表达上调基因9个(ratio>2);表达下调基因5个(ratio<0.5)。结论:nm23-H1基因沉默后,引起显著变化的基因与细胞周期调控和抗凋亡信号转导等生物学功能相关。
- 刘慧金琳张传海熊盛刘秋英王一飞
- 关键词：NM23-H1基因
- 人热休克蛋白90AB1基因克隆、原核表达、中试发酵及纯化
- 2011年
- 通过克隆人热休克蛋白90AB1基因(Hsp90AB1),构建其原核表达载体pET28a(+)-hHsp90AB1,表达纯化获得目的蛋白,为hHsp90靶向药物筛选奠定基础。提取宫颈癌HeLa细胞总RNA,并经RT-PCR获得hHsp90AB1-cDNA。以hH-sp90AB1-cDNA为模板进行PCR体外扩增,胶回收纯化hHsp90AB1。将hHsp90AB1及pET-28a(+)质粒经NdeⅠ和SalⅠ双酶切、胶回收纯化酶切片段后,体外连接酶切片段,使其定向重组,再将重组DNA转化DH5α,经复苏后,在含卡那霉素的LB固体养基上筛选出阳性克隆。挑取LB固体培养基上的单菌落经酶切及测序鉴定,证实为阳性克隆,即pET28a-hHsp90AB1体外重组成功,命名为pET28a(+)-hHsp90AB1。重组质粒转化Rosetta(DE3)菌株,IPTG诱导表达,并对表达条件优化,以及通过SDSA-PAGE和Western blotting分析均表明Hsp90AB1蛋白得到了正确的表达,且表达产物以可溶性形式存在,优化条件下蛋白表达量约占菌体总蛋白13%。接种到18 L发酵罐中试发酵,表达产物经Ni-NTA凝胶亲和层析,蛋白纯度达到98%。
- 刘凯胜王绍祥刘忠张嘉萱张庶民王一飞
- 关键词：克隆原核表达纯化
- 热休克蛋白90抑制剂17-AAG对K562/ADR耐药细胞株生长和凋亡的影响被引量：5
- 2010年
- 目的研究热休克蛋白90抑制剂17-AAG对耐药白血病细胞生长的影响及其诱导的细胞凋亡作用,为白血病的治疗提供新的研究思路。方法采用MTT法检测17-AAG对细胞增殖抑制的剂量-时间-效应关系;激光共聚焦DA-PI染色法观察细胞形态学变化;流式细胞术检测细胞凋亡、周期及P-糖蛋白(P-gp)的变化,Western blot检测细胞凋亡相关蛋白的变化。结果 17-AAG能够明显抑制K562/ADR细胞的生长,大量细胞的核内DNA发生断裂,细胞核边缘化,加药组细胞凋亡率与对照组相比明显增高;加药后细胞被阻滞在G1期,procaspase-3和cleaved Caspase-3表达升高。结论 17-AAG可以通过诱导耐药细胞株K562/ADR的凋亡而抑制细胞生长。P-gp和Caspase-3的表达与凋亡事件的发生具有一定的相关性。
- 王蕊刘忠王绍祥张嘉萱熊盛徐石海王一飞
- 关键词：K562/ADRHSP90抑制剂凋亡17-AAGP-糖蛋白
- 小檗碱对K562细胞分化及凋亡的影响被引量：7
- 2009年
- 目的:研究小檗碱对K562细胞是否具有抑制增殖、促进分化、诱导凋亡的作用,为临床应用黄连治疗慢性粒细胞白血病提供理论依据。方法:MTT比色法、克隆形成实验检测小檗碱对K562细胞增殖的影响;瑞氏-吉姆萨染色观察细胞凋亡的形态改变;DNA琼脂糖凝胶电泳检测晚期细胞凋亡;流式细胞术分析细胞周期分布,细胞表面分化抗原表型检测分析细胞分化。结果:小檗碱对K562细胞的生长有抑制作用;小檗碱与Ara-C联用存在一定的协同效应;小檗碱处理K562细胞48h后能明显促进其向红系、粒系、巨核系分化,随着作用时间的延长小檗碱诱导K562细胞发生凋亡的百分比逐渐增加。结论:小檗碱能有效地抑制K562细胞的增殖,其作用可能是通过诱导K562细胞发生G0/G1期和(或)G2期阻滞并进一步诱导其凋亡和分化实现的。
- 金琳廖红娟张美英刘秋英王一飞
- 关键词：小檗碱K562细胞增殖分化凋亡
- 人Hsp90α基因克隆、中试发酵及生物信息学分析被引量：3
- 2011年
- 目的:克隆获得人热休克蛋白90α(Hsp90α)基因,构建其原核表达载体,分离纯化重组蛋白,为Hsp90抑制剂的体外筛选奠定基础。方法:TRIzol Reagent法提取K562细胞总RNA,通过RT-PCR获得Hsp90α-cDNA。以该cDNA为模板PCR扩增Hsp90α基因,目的基因和质粒pET28a(+)经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后,连接酶切片段,将重组DNA转化DH5α,酶切及测序鉴定重组体。将构建好的重组质粒转化Rosetta(DE3)菌株,IPTG诱导,经条件优化后进行中试发酵、纯化以及Western blot鉴定。结果:原核表达载体pET28a(+)-Hsp90α成功构建,可在Rosetta(DE3)中正确表达,中试发酵收菌574g且表达产物以可溶性形式存在,纯化产物纯度为97%。结论:利用分子克隆技术建立了Hsp90α基因的原核表达和中试发酵的条件,为更深入地研究其在抗肿瘤治疗中的作用打下基础。
- 刘凯胜邱贤秀王一飞
- 关键词：HSP90Α克隆原核表达生物信息学
- 新型Hsp90抑制剂-SNX-2112的小鼠骨髓微核试验研究
- 2010年
- 目的:通过小鼠骨髓微核试验来研究SNX-2112的遗传毒性。方法:昆明小白鼠尾静脉注射SNX-2112,24 h后处死动物,取双侧股骨制备骨髓细胞悬液,进行骨髓推片和姬姆萨染色,在显微镜下选择细胞分布均匀和着色好的区域阅片,计数含微核嗜多染红细胞(polychromatic erythrocyte,PCE)数。比较各实验组及阳性对照组与阴性对照组的微核率。结果:空白溶媒组及SNX-2112低剂量组与阴性对照相比差别均无显著性(P>0.05),SNX-2112中剂量及SNX-2112高剂量组与阴性对照相比差别有统计意义(P(0.05)。结论:SNX-2112在一定剂量范围内对小鼠染色体无明显的损伤作用。
- 龚国琴王庆端江金花王晓王一飞
- 关键词：微核试验
- 新型Hsp90抑制剂——SNX-2112对大鼠肝药酶活性的影响被引量：1
- 2010年
- 目的研究SNX-2112注射液对大鼠肝药酶活性的影响。方法大鼠分为苯巴比妥钠诱导组、CCl4抑制组、SNX-2112高、中、低(10、5、2.5mg·kg-1)剂量组、生理盐水对照组、空白溶媒组。用紫外分光光度法测定了SNX-2112注射液对大鼠肝脏系数、CYP450含量以及甲醛生成速率的影响。结果3种剂量SNX-2112对大鼠肝脏系数以及蛋白含量的影响都不明显,但均能抑制CYP450含量。从甲醛生成速率结果看,高、中两种剂量SNX-2112均能抑制大鼠氨基比林-N-脱甲基酶活性及红霉素-N-脱甲基酶活性,而低剂量对其影响不明显。结论SNX-2112注射液在高浓度对大鼠肝药酶CYP3A和CYP2E1亚型活性有抑制作用。
- 翟倩倩龚国琴王庆端江金花夏敏刘忠利奕成刘秋英邢国文王一飞
- 关键词：CYP450肝微粒体
