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慢病毒介导稳定表达增强小反刍兽疫病毒复制的山羊Vero/SLAM细胞系的建立被引量：4: 2019年; 利用Gateway技术和慢病毒表达系统将山羊淋巴细胞信号活化因子SLAM稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,建立稳定表达可增强小反刍兽疫病毒(PPRV)复制的SLAM的Vero阳性细胞亚克隆,并验证阳性细胞亚克隆Vero/SLAM表达SLAM的活性、遗传稳定性及其对PPRV复制的增殖效果。分离山羊外周血淋巴细胞,提取基因组Total RNA,一步RT-PCR获得完整ORF的SLAM基因,采用BP及LR位点的基因重组技术,构建入门载体pDONR/SLAM并获得表达骨架pDEST/SLAM,与Packaging Mix pLP1、pLP2及VSV-G共转染293-FT细胞,获得SLAM复制缺陷型慢病毒样粒子,用其感染Vero细胞,杀稻瘟菌素抗性筛选获得阳性细胞克隆,通过靶标基因扩增、间接免疫荧光、激光扫描共聚焦显微技术、Western blot免疫印迹检测技术、致细胞病变效应及Realtime RT-PCR等技术分别验证SLAM基因组整合、转录,SLAM蛋白表达、反应活性以及PPRV在表达SLAM阳性细胞亚克隆上的增殖效果。结果显示:SLAM受体基因被稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,该受体蛋白表达于细胞周质,建立的细胞连续传代不丢失,接种病毒后致细胞病变时间由4～7d缩短为3.5d,TCID_(50)·0.1mL^(-1)由4.25增加为5.67,相对于正常Vero细胞,整合有SLAM的Vero细胞,由于表达了PPRV特异的细胞受体使PPRV对其易感性显著增强。成功建立一株稳定表达靶向增强PPRV复制的Vero/SLAM细胞:该细胞表达的SLAM具有明显增强PPRV复制的功能,不仅可以从细胞模型水平阐明增强PPRV复制的关键靶基因,也为PPRV感染引起宿主细胞的变化以及对机体的致病机制等提供研究工具。; 吴锦艳田宏蒙学莲惠小婷王耀杰关玉华尚佑军刘永生张志东; 关键词：小反刍兽疫病毒 SLAM GATEWAY技术

羊口疮病毒ORFV129蛋白对树突状细胞成熟和功能的影响被引量：4: 2019年; 为了探讨羊口疮病毒ORFV129蛋白对小鼠骨髓树突状细胞(DCs)生物免疫学功能的影响,从小鼠骨髓腔中分离获得单核细胞,诱导分化为未成熟DCs并用不同浓度的ORFV129蛋白进行刺激,采用流式细胞术检测成熟DCs的表面标记物MHC-Ⅱ、CD40等表达及吞噬FITC-dextran的能力,以及检测ORFV129蛋白作用DCs后分泌IFN-γ、IL-6等细胞因子的水平;采用CCK8法检测ORFV129蛋白对DCs刺激T细胞增殖的影响以及检测培养上清中IFN-γ、IL-5的水平。结果显示,经10μg与5μg浓度的ORFV129蛋白作用24 h后,DCs表面分子CD80、CD40的表达显著上调,与未处理组相比差异显著(P<0.05);经ORFV129蛋白刺激后DCs吞噬FITC-dextran的能力下降;10μg的ORFV129蛋白极显著地促进了IFN-γ、IL-6、IL-12p40等细胞因子的表达,与空白组相比差异极显著(P<0.01);另外,经ORFV129蛋白处理的DCs还可刺激T细胞增殖,以及使培养上清中IFN-γ的分泌量显著增加。ORFV129蛋白可上调DCs表面MHC-Ⅱ、CD40、CD80和CD86分子表达,降低其吞噬能力,促进DCs分泌IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-12p40等细胞因子,还可刺激T细胞增殖,表明ORFV129蛋白对DCs的成熟起到促进作用。; 杜国玉吴锦艳曹小安李玲霞冯倩尹双辉周建华刘永杰尚佑军刘湘涛刘永生; 关键词：树突状细胞 T淋巴细胞

不同杂交组合育肥羔羊生长、屠宰性能和肉品质的研究被引量：10: 2013年; 通过饲养试验对3个不同杂交组合育肥羔羊生产性能、屠宰性能和肉品质进行了研究,为选育优质肉羊品种提供理论基础。选取杜寒14只,南本18只,寒本12只为研究对象,相同条件下,饲养到9月龄,选取部分试羊进行屠宰,比较其屠宰性能和肉品质。结果表明:杜寒F1羔羊全期平均日增重达252.81 g,极显著高于寒本(P<0.01),显著高于南本(P<0.05),南本显著高于寒本(P<0.05);杜寒的屠宰率和净肉率极显著高于寒本(P<0.01),显著高于南本(P<0.05),南本与寒本差异不显著(P>0.05);南本的大理石纹极显著高于杜寒与寒本(P<0.01)。南本的熟肉率显著高于寒本(P﹤0.05)。杜寒杂交组合生产性能和屠宰性能优势明显。; 闫秋良金海国赵玉民曹阳孙仁赵云辉武斌马惠海; 关键词：育肥羔羊杂交组合屠宰性能

羊口疮病毒ORF129基因的原核表达、纯化及鉴定被引量：4: 2018年; 试验旨在克隆羊口疮病毒ORF129基因,并对其编码蛋白进行表达及纯化。参照GenBank已发表羊口疮病毒OV-IA82株ORF129基因序列(登录号:AY386263.1),用Primer Premier 5.0软件设计合成1对特异性引物,利用PCR方法扩增ORF129全基因序列,将其与质粒pET-28a(+)经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后连接,构建重组质粒pET-28a(+)-ORF129。重组质粒经双酶切和测序鉴定后转化大肠杆菌Rosttta感受态细胞,利用IPTG诱导ORF129基因的表达,经SDS-PAGE分析后,将表达产物超声破碎、洗涤、溶解,然后采用尿素梯度透析方法进行复性,经亲和层析法纯化目的蛋白并通过Western blotting对其进行鉴定。双酶切鉴定和测序结果表明,本试验成功构建了重组质粒,读码框正确,菌液起始D600nm值为0.4~0.8,37℃、220r/min、1mmol/L IPTG诱导3h时能得到ORF129包涵体蛋白,蛋白大小为58ku,在加入精氨酸、甘油的复性液中,蛋白复性率较高,将复性后蛋白与Ni柱结合,在咪唑浓度为500mmol/L时,能将蛋白洗脱,纯化的蛋白经Western blotting鉴定正确,证明蛋白成功表达。本研究成功构建了羊口疮病毒ORF129基因原核表达重组质粒,并成功表达和纯化了ORF129蛋白,为后续羊口疮病毒检测方法的建立奠定基础。; 杜国玉刘永杰吴锦艳王光祥尚佑军张勇; 关键词：羊口疮病毒原核表达

羊口疮病毒疫苗株与野毒株VIL-10基因的比较分析被引量：3: 2018年; 试验旨在比较分析羊口疮病毒(orf virus,ORFV)VIL-10基因在疫苗株和野毒株之间的差异特征。参照GenBank中公布的ORFV NZ2株的VIL-10基因序列设计并合成1对特异性引物,分别以疫苗株和野毒株提取的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增ORFV的VIL-10基因全序列并进行测序,应用生物信息学相关软件分析基因的核苷酸、氨基酸变异情况及蛋白结构。结果显示,本试验测定的疫苗株和野毒株VIL-10基因核苷酸序列同源性为94.4%,差异主要是单个碱基的突变,其中疫苗株在132~134bp核苷酸序列出现缺失;氨基酸序列同源性为92.5%,出现了15个氨基酸位点的突变,其中疫苗株第42位氨基酸天冬酰胺出现缺失;蛋白质在一级结构及理化性质、二级结构、三级结构、抗原表位参数及有无信号肽之间均存在一定程度的差异,而疫苗株和野毒株编码的蛋白质均无跨膜结构域。系统进化树分析结果表明,本试验测定的野毒株与疫苗株属于不同分支,遗传关系较远。研究结果提示,野毒株与疫苗株的VIL-10基因发生较明显的变异,这些变异可能与ORFV疫苗株的毒力致弱有关。; 冯倩吴锦艳陈妍刘永杰张克山尚佑军刘湘涛; 关键词：疫苗株野毒株

内蒙古规模化羊场羊流产病原与抗体的检测分析: 2023年; 为了诊断引起内蒙古羊场怀孕母羊流产的病原因素,通过对流产母羊血清、流产胎儿和胎衣等样本进行抗体检测、病理剖检、PCR扩增、核苷酸序列比对、同源性分析和构建系统进化树等方法进行检测分析。结果布鲁氏菌检出率最高(34.28%),流产衣原体次之(28.57%),伯氏柯克氏体与布鲁氏菌的混合感染和3种病原体的混合感染检出率最低(2.86%)。说明检测羊场中均存在流产衣原体、伯氏柯克氏体和布鲁氏菌单独感染或混合感染的情况,且3种病原体保守性较高,为检测羊场及周边其他羊场疫病防控提供了科学依据。; 郑红飞张成泽让卓玛曹小安张登基卢旺银尚佑军; 关键词：流产衣原体布鲁氏菌

利用50K芯片数据分析中国11个地方绵羊群体的遗传结构被引量：11: 2016年; 旨在构建我国绵羊群体遗传结构的精细图谱,为我国绵羊遗传资源的保存、利用提供依据。利用乌珠穆沁羊、湖羊、同羊、大尾寒羊、罗布羊、哈萨克羊、多浪羊、迪庆羊、青海臧羊、四川藏羊、西藏藏羊共计11个地方绵羊品种(资源)的Illumina Ovine SNP 50K芯片数据,应用NETVIEW、PCA、STRUCTURE、NJ树等方法对群体结构进行分析。结果表明,乌珠穆沁羊与除罗布羊以外的蒙古系绵羊均有直接遗传关系,与罗布羊有间接的遗传关系。罗布羊与哈萨克系绵羊有较近的遗传关系,而哈萨克系的哈萨克羊与多浪羊存在较远的遗传关系。迪庆羊能够与藏系绵羊分离开,西藏地区藏羊能够与其他地区的藏羊分开,青海、四川的藏羊不能分开。结果提示,NETVIEW计算时间短,且基本能够反映史实,因而可以作为未来群体结构分析的工具;乌珠穆沁羊是此次试验选用的蒙古系绵羊中最古老的品种;蒙古系的罗布羊因混有哈萨克系绵羊的血统而与新疆地区的绵羊聚在一起;不同地区的藏羊存在着分化趋势,但分化并不严重。; 袁泽湖王慧华胡师金朱才业赵福平张莉杜立新魏彩虹; 关键词：绵羊

小反刍兽疫病毒对鼠源树突状细胞成熟分化的影响被引量：2: 2018年; 目的研究和探讨小反刍兽疫病毒(PPRV)对小鼠骨髓来源的树突状细胞(BM-DCs)成熟和分化功能的影响。方法从小鼠骨髓中分离得到DCs,经过IL-4和GM-CSF诱导成熟;流式细胞术检测DCs表面共刺激分子表达及吞噬FITC-Dextran的能力;ELISA检测细胞因子IL-6、IL-12p40、IL-1β和IL-10的表达水平。结果利用LPS和PPRV处理DCs 24 h,发现与阳性对照LPS组相比,PPRV作用后显著抑制了CD40和MHC-Ⅱ的表达(P<0.05);滴度适度的PPRV可以显著增加CD40、CD80和CD86的表达,显著升高IL-6和IL-10的分泌(P<0.05),吞噬FITC-Dextran的能力并无显著差异,各组之间也无影响,且不同比例的PPRV对DC存活率无显著影响(P>0.05)。结论 PPRV在一定滴度范围内具有潜在的促进小鼠DC成熟的功能,为免疫学研究奠定基础。; 李玲霞吴锦艳杜国玉冯倩王光祥陈研曹小安刘永生刘湘涛尚佑军; 关键词：小反刍兽疫病毒流式细胞术

口疮病毒112基因的原核表达及生物信息学分析: 2018年; 为了确证口疮病毒112基因的免疫学特性,本研究参考Gen Bank载录的口疮病毒NZ2株112基因序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增口疮病毒112全基因,连接到原核表达载体p ET-28a（＋）中,将测序正确的重组质粒命名为p ET-28a（＋）-ORFV 112,并转化到Rosetta（DE3）感受态细胞中,用IPTG进行诱导重组ORFV 112蛋白表达,并分别进行SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定,并运用生物信息学软件对口疮病毒112蛋白的性质和结构进行预测分析。结果表明,ORFV 112基因的大小约为861 bp;通过重组表达的融合蛋白大小约为40 ku;SDS-PAGE和Western-blot分析表明,该蛋白具有免疫反应原性。预测分析表明,ORFV 112蛋白分子式为C1357H2155N367O451S11,理论等电点（PI）为4.68,消光系数为23 295,脂肪指数为81.78,总平均疏水性（GRAVY）为-0.383,其二级结构主要以α-螺旋（29.37%）和无规则卷曲（40.56%）构成。本研究为深入研究口疮病毒112蛋白结构与功能及该蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础。; 冯倩吴锦艳王光祥陈妍杜国玉李玲霞尚佑军张志东刘湘涛; 关键词：原核表达生物信息学分析

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国家肉羊产业技术体系建设项目(CARS-39-04B)

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