北京市自然科学基金(7072012)
- 作品数：6 被引量：36H指数：4
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- 相关机构：首都医科大学附属北京安贞医院北京市心肺血管疾病研究所更多>>
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- 人脐带间充质干细胞的原代培养及多向分化潜能的研究被引量：10
- 2013年
- 目的探讨人脐带间充质干细胞（hUCMSC）的体外分离培养鉴定方法及多向分化潜能。方法应用Ⅱ型胶原酶和透明质酸酶联合消化法及组织贴块培养法对hUCMSC进行体外培养。在倒置显微镜下观察不同方法获得的hUCMSC的生长特点；台盼蓝法测定细胞传代成活率；采用生长曲线、MTT法测定hUCMSC的增殖、流式细胞术（FCM）测定细胞周期变化及细胞免疫表型变化；采用相应试剂盒鉴定其向成脂细胞、成骨细胞的分化，采用免疫荧光细胞化学技术检测向成心肌样细胞的分化、采用荧光标记技术检测hUCMSC向血管内皮细胞的分化。结果酶消化法分离培养的细胞1d后，在倒置相差显微镜下可见细胞贴壁呈圆形生长，4d后生长迅速呈长梭形，7d后由中心向周围生长且增殖明显，10d后达80％融合即可传代；贴块法培养的细胞7d后，可见细胞从组织块边缘长出，10d后细胞数量逐渐增多，16d后细胞生长迅速呈单层致密排列即可传代，细胞传代成活率均为96％以上。2种方法获得的第3代细胞生长曲线近似“S”形、MTr法显示3～5d细胞增殖较明显；酶消化法培养的细胞G0／G1期和s＋G2／M期所占比例分别为88．78％和10．21％，组织贴块法培养的细胞G0／G1期和S＋G2／M期所占比例分别为84．82％和13．87％，细胞DNA周期无明显差异；2种方法获得的细胞经FCM检测CD90、CD105、CD73阳性率均为99％以上为高表达；CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19、HLA—DR低表达；2种方法获得的细胞在体外诱导都能向成骨细胞、成脂细胞、成心肌样细胞及血管内皮细胞分化，其诱导阳性率均为90％以上。结论酶消化法和贴块法均可高效获得hUCMSC，与贴块法培养相比较，酶消化法能更有效的获得扩增迅速、细胞成分单一的细胞。
- 辛毅李娜黄益民崔巍刘飒许秀芳张兆光
- 关键词：人脐带间充质干细胞原代培养诱导分化
- 绿色荧光蛋白转基因小鼠不同源性间充质干细胞原代培养及生物学特性比较被引量：1
- 2014年
- 目的：探讨绿色荧光蛋白转基因小鼠脐带和骨髓源性间充质干细胞（ MSCs ）的体外分离培养方法、生物学特性、表面标志及多向分化潜能。方法：应用Ⅱ型胶原酶消化培养法分离脐带MSCs及密度梯度离心法分离骨髓MSCs进行体外培养。在倒置显微镜下观察2种细胞的生长特点，运用生长曲线和MTT法检测其原代细胞增殖能力，台盼蓝法测定细胞传代成活率，采用流式细胞术测定2种第3代（ P3）细胞DNA周期及表面标志物的表达，并比较其向成脂细胞和成骨细胞的分化潜能。结果：酶消化法分离培养的脐带MSCs 1 d后，细胞贴壁呈成纤维形，2 d后呈漩涡状生长且增殖明显，3 d后达80％融合即可传代；应用密度梯度离心法分离骨髓MSCs，体外培养4 d后，细胞贴壁呈圆形、梭形和多角形生长，5 d后呈克隆样生长且增殖明显，7 d后达80％融合即可传代。原代培养的脐带MSCs生长曲线近似“S”形，骨髓MSCs 生长曲线较平缓；MTT法显示脐带MSCs在3～5 d增殖较明显，骨髓MSCs 7 d后细胞增殖较明显。2种P3细胞传代成活率均为96％以上，G0／G1期细胞均为85％以上，无明显差异（P＞0．05）；2种P3细胞CD44、CD90和CD105阳性率均为（60．7±2．3）％以上高表达，CD45、CD19、CD14和CD79a均为（25．6±4．8）％低表达，两者无明显差异（ P＞0．05）；2种MSCs在体外均具有向成骨细胞和成脂细胞分化的潜能，脐带MSCs向成骨及成脂细胞分化率均为90％以上，与骨髓MSCs的分化潜能比较有显著差异（ P＜0.05）。结论：脐带MSCs较骨髓MSCs具有较强的增殖能力及分化潜能。绿色荧光蛋白转基因小鼠的脐带MSCs可作为较好干细胞示踪的细胞源。
- 辛毅李娜张颖黄益民刘飒许秀芳张兆光
- 关键词：脐带间充质干细胞生物学特性绿色荧光蛋白转基因小鼠
- 小鼠骨髓间充质干细胞定向诱导分化血管内皮细胞的实验研究被引量：7
- 2014年
- 目的探讨体外小鼠骨髓间充质干细胞(mBMMSCs)的分离培养对其定向诱导分化为血管内皮细胞(VECs)的可行性。方法采用全骨髓贴壁法,分离骨髓间充质干细胞(MSCs)体外纯化培养并传代,倒置显微镜观察原代细胞形态变化,采用生长曲线法及3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法观察传代细胞生长特性。采用第3代mBMMSCs在内皮细胞生长培养基(EBM-2)中以血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)进行定向诱导,观察细胞形态学变化;流式细胞仪分析比较第3代mBMMSCs及诱导后细胞DNA周期、细胞免疫表型的变化;免疫细胞荧光技术分别检测CD31、vWF和CD34表达及摄取Di-lac-LDL结合FITC-UEA-1的功能特点;体外血管形成实验检测血管内皮细胞的功能。结果 mBMMSCs原代培养呈长梭形、漩涡状排列生长,P1、P2、P3细胞生长曲线及MTT法显示呈潜伏期、对数生长期及平台期生长。诱导后的部分细胞形态可见类似血管内皮样改变,呈多角形、短梭形、铺路石样排列生长;细胞周期分析显示,第3代mBMMSCs G0/G1期为86%,诱导分化后的细胞G0/G1期为92%,细胞DNA周期无明显差异;第3代mBMMSCs免疫表型结果显示为CD105、CD90、CD73、CD44阳性表达,而CD34、CD45、VEGF(CD309)、CD14阴性表达;诱导分化后的细胞VEGF(CD309)、CD34弱阳性表达,而CD105、CD90、CD73、CD44、CD45、CD14阴性表达;细胞免疫荧光技术检测第3代mBMMSCs表面CD31、vWF和CD34阴性表达,不具有摄取Dil-ac-LDL、结合FITC-UEA-1的功能特点及形成血管管腔样结构;诱导后的细胞表达VECs特异性表面标志CD31、vWF和CD34,具有摄取Di-lac-LDL、结合FITC-UEA-1的功能特点及体外可形成血管管腔样结构。结论采用全骨髓贴壁法培养的mBMMSCs在体外具有定向诱导分化为VECs的潜能,成为血管组织工程理想的细胞来源。
- 辛毅李娜黄益民刘飒许秀芳张兆光
- 关键词：骨髓间充质干细胞血管内皮细胞诱导分化小鼠
- 小鼠活体内hMSCs干细胞生物发光示踪监测被引量：8
- 2010年
- 目的:利用慢病毒载体转染和生物发光技术实时监测小鼠活体内人骨髓间充质干细胞(hMSCs)。方法:构建萤火虫荧光素酶(LUC)慢病毒载体,转染hMSCs后注射到小鼠皮下,(IVIS)生物发光成像系统连续检测体外hMSCs和小鼠注射部位的发光强度。结果:1.慢病毒载体对hMSCs的转染率为(29.6±1.5)%,转染后20代的hMSCs仍稳定表达LUC;2.慢病毒载体对hMSCs的生长和增值没有影响;3.小鼠活体内生物发光强度与注射细胞数量成正比(R2=0.9826);4.小鼠活体内生物发光时间持续6d。结论:可利用慢病毒载体转染LUC对小鼠活体内移植的hMSCs进行生物发光示踪监测。
- 黄益民张颖辛毅胡著涛罗毅
- 关键词：慢病毒载体荧光素酶生物发光成像
- 成年小鼠心成纤维细胞的原代培养及生物学特性被引量：3
- 2012年
- 目的:建立适用于成年小鼠心成纤维细胞的体外分离培养及鉴定的技术方法。方法:应用胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶联合消化法及组织贴块法两种方法对小鼠心成纤维细胞进行体外培养。在倒置显微镜下观察心成纤维细胞生长情况;台盼蓝法测定细胞传代成活率;通过绘制生长曲线法、MTT法、DNA周期检测比较两种方法获得的心成纤维细胞的增殖情况;观察不同培养基对心成纤维细胞生长的影响;苏木素-伊红(HE)染色观察细胞形态,采用免疫荧光染色观察培养细胞波形蛋白、纤维连结蛋白及盘状结构域受体2(DDR2)的表达。结果:酶联合消化法分离培养的细胞1 d后,在倒置相差显微镜下可见细胞贴壁呈长椭圆形生长,3 d后生长迅速呈长梭形;贴块法培养的细胞4 d后,可见细胞从组织块边缘长出,7 d后细胞数量逐渐增多,细胞成活率均为97%。两种方法获得的第3代细胞生长曲线近似"S"形、MTT法显示3～5 d细胞增殖较明显;酶联合消化法培养的细胞G0-G1期和S+G2+M期所占比例分别为62.61%和30.87%,组织贴块法培养的细胞G0-G1期和S+G2+M期所占比例分别为69.24%和28.05%;含100 mL/L胎牛血清的HG/DMEM培养基培养的细胞出现明显对数期。两种方法培养的第3代细胞行苏木素-伊红染色可见细胞漩涡状排列,免疫荧光检测波形蛋白、纤维连接蛋白及盘状结构域受体2表达阳性。结论:两种方法均可高效获得心成纤维细胞在体外稳定培养。与贴块法培养相比较,利用联合酶消化法能较有效的获得波形蛋白、纤维连结蛋白、DDR2高表达阳性的心成纤维细胞。
- 辛毅刘飒许秀芳李温斌黄益民罗毅周玉杰
- 关键词：成年小鼠生物学鉴定
- 差速贴壁法分离兔骨髓源性间充质干细胞和内皮祖细胞及其生物学特性的研究被引量：10
- 2013年
- 本研究探讨一种高效、稳定的从兔骨髓中同时分离培养间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC)和内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPC)的方法并观察其生物学特性。抽取兔骨髓,应用密度梯度分离单个核细胞,采用差速贴壁经纤连蛋白包被并结合EGM-2MV培养基分别扩增MSC和EPC。用台盼蓝法测定细胞传代成活率,通过绘制生长曲线法、MTT法、DNA周期检测MSC和EPC的增殖能力及诱导分化成骨细胞、成脂肪细胞能力,并结合流式细胞术(FCM)检测MSC免疫原型以鉴定MSC;细胞吞噬功能特异性地摄取Dil-ac-LDL及FITC-UEA-1,并结合CD133、VEGFR2/KDR、CD34免疫荧光鉴定EPC,并计算其纯度。结果表明,经密度梯度分离单个核细胞,在早期贴壁细胞24 h换液时即可见明显集落形成,8 d后达80%融合,细胞呈均匀一致的长梭形排列;2次贴壁细胞经EGM-2MV培养基培养,第3天开始伸展,约8 d可融合近80%,细胞呈多角形,出现条索状结构;2种细胞台盼蓝法测定细胞传代成活率均在90%以上,传至第2代后,生长曲线均近似"S"形;MTT法检测显示,细胞生长d 3至d 5时光密度值变化较明显;MSC G0-G1期为(93.32±1.65)%、EPC G0-G1为(93.05±1.95)%,2种细胞DNA周期无明显差异;早期贴壁细胞FCM检测CD90、CD44阳性率为(99.7±1.12)%、(99.1±2.33)%;CD14、CD45、CD79a阳性率分别为(4.8±0.38)%、(6.8±0.49)%及(0.4±0.08)%,经体外诱导能够向成骨细胞及脂肪细胞分化,鉴定为MSC;2次贴壁细胞传至第2代经Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1双荧光染色阳性率(82.1±3.4)%,CD133、VEGFR2/KDR、CD34免疫荧光染色阳性率分别为(74.2±3.2)%、(64.7±4.3)%及(43.5±1.5)%,鉴定为EPC。结论:应用密度梯度分离法结合差速贴壁筛选法可培养出高纯度的MSC,2次贴壁细胞经纤连蛋白预包被并结合EGM-2MV培养基体外诱导可培养出增殖能力较强的EPC,为组织工程学研究提供种子细胞。
- 辛毅刘小希赵伟刘飒刘飒李娜许秀芳黄益民罗毅
- 关键词：差速贴壁法骨髓间充质干细胞内皮祖细胞细胞培养生物学特性
