国家现代农业产业技术体系建设项目(CARS-43-10)
- 作品数：10 被引量：75H指数：5
- 相关作者：刁有祥陈浩杨晶牛晓宇于相龙更多>>
- 相关机构：山东农业大学中国农业大学东北农业大学更多>>
- 发文基金：国家现代农业产业技术体系建设项目山东省科技发展计划项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 鸭瘟病毒单抗的制备及胶体金试纸条检测方法的建立被引量：6
- 2016年
- 【目的】鸭瘟（DP）是由鸭瘟病毒（DPV）引起的一种急性、败血性传染病,以头颈肿胀、食道黏膜和泄殖腔黏膜出血、黄白色溃疡,头颈部皮下有黄白色胶冻样渗出为特征。该病一旦发生,发病急、死亡快、死亡率高,对养鸭业危害严重。快速诊断是控制鸭瘟的重要措施之一,可以及时确定病原,以便采取有效的防制手段。试验旨在建立鸭瘟病毒（DPV）胶体金快速检测方法。【方法】利用生物学软件Protean分析,选择鸭瘟病毒抗原表位较多的一段序列设计引物,PCR扩增目的基因。连接到载体pMD-18T上,测序正确后再连接到原核表达载体pET-28a上。将获得的重组质粒转化至Rosetta感受态细胞中进行诱导表达。表达的蛋白经纯化后测其浓度并经Western blotting鉴定分析。以表达的DPV-gB蛋白作为抗原,免疫7周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选及亚克隆,获得DPV-gB特异性单克隆抗体。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,以制备的H6F6单抗作为标记抗体（标记的最适pH为8.0—8.5,最佳标记浓度为15倍原液稀释）,将纯化的A8D7单抗（浓度为2倍原液稀释）和羊抗鼠IgG（浓度为10倍稀释）包被在硝酸纤维素膜（NC）上,分别作为检测线和质控线,经条件优化建立了鸭瘟病毒胶体金试纸条检测方法。【结果】共获得4株能稳定分泌抗DPV-gB蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为A8D7、E6C3、H11F8、H6F6。间接ELISA检测腹水效价分别为1：10^3、1：10^3、1：10^5、1：10^3。亚类鉴定结果分别为IgG2b、IgG2a、IgG2b、IgG1,轻链均为kappa链。Western blotting结果显示4株单抗均能与DPV-gB蛋白特异性结合。IFA结果显示制备的4株单抗是针对DPV产生的。建立的胶体金试纸条方法能够特异性地检测鸭瘟病毒,与鸭坦布苏病毒、H9N2亚型禽流感病毒、呼肠孤病毒、减蛋综合征病毒无反应。阳性尿�
- 赵丹丹杨国平刁有祥陈浩提金凤张璐张英李川川
- 关键词：鸭瘟病毒原核表达单克隆抗体胶体金试纸条
- 鸭细小病毒套式PCR检测方法的建立与应用被引量：9
- 2016年
- 鸭细小病毒是新近发生的引起樱桃谷肉鸭短喙、长舌、发育迟缓的1种新型水禽细小病毒,目前尚无可靠的快速诊断方法。本研究根据鸭细小病毒的VP3基因设计了2对特异性引物,建立了套式PCR检测方法。该方法对鸭细小病毒DNA的最低检出量为100copies,不能扩增鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭肠炎病毒等。采用该方法对采自山东、江苏、安徽等地的30份疑似鸭细小病毒感染病料进行检测,结果显示阳性率为27/30(90%),与病毒分离结果符合率为90%;而普通PCR的阳性检出率为8/30(26.7%)。上述结果表明,建立的套式PCR方法具有较高的敏感性和特异性,可用于鸭细小病毒的临床诊断和分子流行病学调查。
- 窦砚国陈浩郑肖强于相龙杨晶牛晓宇刁有祥
- 关键词：套式PCR樱桃谷肉鸭
- 一株鹅源呼肠孤病毒的分离鉴定及致病性研究被引量：5
- 2017年
- 【目的】从疑似感染鹅呼肠孤病毒的病料中分离鉴定一株鹅源呼肠孤病毒JS-01,并对病毒分离株的致病性进行初步研究,为开展该病毒的进一步研究奠定基础。【方法】取病死鹅的肝、脾组织冻融3次后充分匀浆,8 000r/min离心15min取上清,接种10日龄鹅胚的卵黄囊,收集24~144h死亡的鹅胚尿囊液,并提取病毒RNA。根据鹅呼肠孤病毒基因的保守序列设计特异性引物,利用该引物对所提取的病毒RNA进行RT-PCR,回收后与pMD18-T载体连接,将重组载体转化到DH5α大肠杆菌并在AMP+/LB培养基中培养,对阳性菌落测序,对测得的序列进行核苷酸及氨基酸同源性比对,并绘制系统遗传进化树。【结果】分离病毒JS-01的RT-PCR显示,其基因序列长度380bp,为鹅呼肠孤病毒σC基因片段;系统遗传进化分析表明,分离株JS-01与水禽源呼肠孤病毒处于同一分支,同源性为94.8%~96.5%,而与鸡呼肠孤病毒的同源性仅为40.6%~52.2%;在雏鹅上进行的动物回归试验表明,病毒JS-01可使雏鹅肝、脾、肾等器官发生病变。【结论】分离毒株为鹅呼肠孤病毒,该分离株对雏鹅有一定致病性,应注意本病的防控。
- 张秉乾刁有祥于相龙张欣窦砚国
- 鸭细小病毒地高辛标记探针的制备与应用被引量：3
- 2016年
- 根据GenBank发表的1株鸭细小病毒全基因组序列设计1对特异性引物,利用PCR扩增得到大小为301bp的片段,回收纯化后用地高辛进行标记,制备鸭细小病毒地高辛标记探针。特异性试验表明,该探针仅与鸭细小病毒发生特异性杂交反应,与GPV、MDPV、DcuV、DEV、DHAV-I、H9N2亚型AIV、N-DRV、NDV、TMUV杂交反应均为阴性。敏感性试验表明,该探针对鸭细小病毒核酸的最低检测量为25pg。应用制备的探针对山东、江苏和安徽等地采集的61份患病鸭和30份健康鸭组织进行检测,阳性率分别为97%和0%,与病毒分离结果符合率为98%。上述结果显示,本研究制备的探针特异性强、敏感性高,为该病的诊断和流行病学调查提供可靠的方法。
- 郑肖强陈浩窦砚国杨晶牛晓宇于相龙刁有祥
- 关键词：地高辛探针
- 禽痘病毒的分离与鉴定被引量：3
- 2016年
- 山东某麻鸡养殖场饲养的5 000只麻鸡,2月龄左右发病,主要表现为鸡冠肉髯出现痘疹,个别鸡只出现死亡。剖检病死鸡可见口腔、咽喉的黏膜覆盖一层黄白色干酪样的伪膜,撕去伪膜后,黏膜呈现红色的溃疡面,内脏器官无明显病变。采集痘疹病料进行病原体的分离培养,确诊该鸡群为禽痘病毒感染。
- 张敏敏提金凤李秀丽杨晶张媛媛王振忠刁有祥
- 关键词：麻鸡禽痘病毒
- 一株鹅圆环病毒的全基因组测序及序列分析被引量：7
- 2015年
- 从山东省潍坊地区某朗德鹅鹅场的发病鹅体内检测到1株鹅圆环病毒，命名为SDWF-01。根据GenBank上已发表的鹅圆环病毒序列，设计了一对特异性引物，利用PCR技术对该株病毒进行全基因组克隆并测序，对其基因组核苷酸组成、结构及遗传进化特性进行分析。结果表明：SDWF-01株全长1821bp，编码4个开放阅读框；与GenBank上已发表的鹅圆环病毒核苷酸序列同源性为91．4％～98．5％，其中sDWF-01株与yk3毒株的同源性最高（98．5％），而与浙江株xs5的同源性最低（91．4％）。研究首次对山东地区鹅圆环病毒进行检测，并完成全基因组克隆测序及核苷酸序列分析。
- 张敏张欣张秉乾郑肖强窦砚国刁有祥
- 关键词：全基因组
- 鸡源新城疫病毒对种鹅的致病性实验被引量：2
- 2016年
- 为研究鸡源新城疫病毒(NDV)对种鹅的致病性,本实验采用分离的一株NDVSDZB株通过静脉注射、点眼滴鼻和模拟自然感染3种途径感染健康种鹅,静脉注射组与点眼滴鼻组种鹅接种2mL/只(10^(-8.5) EID_(50)/0.2mL),模拟自然感染组在其饲养环境中喷洒等量的病毒液,观察实验种鹅发病情况及临床症状,并进行细胞因子和NDV抗体水平的测定、各组织器官的病理变化观察,内脏器官病理组织学检查及利用荧光定量PCR方法测定各组织器官载毒量。结果显示,不同感染途径接种均能够引起种鹅发病,静脉注射组死亡率为80%,点眼滴鼻组与自然感染组无死亡现象。病鹅以排黄白色或黄绿色稀便、产软壳蛋或无壳蛋、扭头和瘫痪为主要特征;细胞因子与抗体水平均呈先上升后下降的趋势;剖检可见各组织器官广泛出血,卵泡出血变形,心脏、脾脏、胰腺等器官有白色坏死灶,卵泡变形萎缩;病理组织学变化表现为心脏、肝脏等组织广泛性出血、变性,胰腺、脾脏淋巴细胞坏死;荧光定量PCR检测结果显示,病毒在鹅体内多个组织器官中分布。上述结果表明,NDV对种鹅具有较强的致病性。
- 张欣刁有祥霍现格窦砚国张秉乾
- 关键词：种鹅新城疫病毒
- 种鸭白色念珠菌的分离与鉴定被引量：1
- 2015年
- 山东聊城某鸭场养殖60 000只种鸭,98日龄开始发病,表现为精神沉郁,采食量及饮水量下降,个别病鸭出现死亡。剖检病变主要表现为消化道黏膜增厚、溃疡,严重者形成乳白色的假膜。刮取黏膜上的假膜进行触片镜检,同时进行病原菌的分离培养,最终分离到了白色念珠菌。
- 提金凤颜敏窦砚国郑肖强刁有祥李舫
- 关键词：白色念珠菌消化道黏膜
- 表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组腺病毒的构建及鉴定
- 2013年
- 为构建表达H 5N 1亚型clade 2.3.4禽流感病毒(AIV)HA基因的重组腺病毒,本研究通过RT-PCR扩增A/wild duck/Shandong/628/2011(H 5N 1)的H A基因,克隆于腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,构建重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV-HA。采用A d-Easy技术,制备表达AIVHA基因的复制缺陷型重组腺病毒rAd-H A。将rA d-HA感染Ad293细胞,可产生明显的细胞病变。通过细胞超薄切片观察到完整的腺病毒颗粒。经RT-PCR、间接免疫荧光及western blot证明HA基因在A d293细胞中成功转录和表达,并且表达的蛋白具有良好的生物学活性。本研究为新型H5N1亚型AIV活载体疫苗的研发奠定了基础。
- 王伟王伟刘春国王寿山张超林刘彦云吕让
- 关键词：禽流感病毒H5N1亚型HA基因重组腺病毒
- 樱桃谷肉鸭短喙长舌综合征病原的分离鉴定被引量：45
- 2015年
- 2015年3月以来,我国山东、江苏和安徽等地肉鸭群出现了一种疾病,该病以鸭喙发育不良,舌头外伸为特征。根据症状,暂将该病命名为鸭短喙长舌综合征（duck beak atrophy and dwarfish syndrome,BADS）。从不同地区5个发病肉鸭群采集130余份样品,取5份样品进行病原的分离。细菌培养结果均为阴性（4株大肠杆菌从肝脏常规分离）;获得5份鸭胚培养物。该培养物不能凝集鸡红细胞。对5株分离株株进行PCR检测,结果显示鸭瘟病毒、坦布苏病毒、鸭甲肝病毒、鸭星状病毒、鸭呼肠孤病毒、鸭圆环病毒、鹅多瘤病毒、鹅腺病毒、禽网状内皮组织增生征病毒等均为阴性,鹅细小病毒呈阳性。采用基于鹅细小病毒VP3基因的PCR方法对74份样品（肝脏和泄殖腔棉拭子）进行检测,阳性率为100%。该分离株661bp的VP3核苷酸序列与鹅细小病毒和番鸭细小病毒进行分析,结果显示该分离株与鹅细小病毒82-0321v株和SHM319株亲缘关系最近,核苷酸同源性分别为98.8%和98.3%;与番鸭细小病毒同源性较低,在77.6%～78.8%之间。用鸭胚分离的SDLC01株感染1日龄雏鸭能引起鸭上、下喙萎缩、舌头外伸等症状。上述结果表明,从BADS患鸭体内分离得到鸭细小病毒（duck parvovirus,DPV）,其可能与BADS具有相关性。
- 陈浩窦砚国唐熠颜敏王爱华郑肖强杨晶牛晓宇张大丙刁有祥
- 关键词：樱桃谷肉鸭
