国家自然科学基金(30470812)
- 作品数：13 被引量：23H指数：3
- 相关作者：孙辽舒晓春叶礼红尹代婵胡芳更多>>
- 相关机构：中山大学中山大学附属第一医院深圳市第五人民医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金珠海市软科学研究计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- TIEG特异的siRNA慢病毒载体的构建及鉴定被引量：1
- 2009年
- 目的构建TIEG基因siRNA慢病毒载体。方法针对已经筛选确定的TIEG基因siRNA有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA退火形成双链DNA与经BamH Ⅰ和EcoRI酶切后的PshRNA-copGFP-lentivector慢病毒载体[含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生psiR NA-TIEG慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定,用psiRNA-TIEG和病毒包装系统共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度;用包装病毒颗粒注射大鼠,通过RealTime-PCR检测大鼠肾组织TIEG mRNA的表达水平。结果PCR和测序证实,成功构建TIEG siRNA慢病毒载体psiRNA-TIEG,包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为1×105ifu/μL;实验组大鼠TIEGmRNA的表达水平明显低于对照组(50.7%)。结论成功构建大鼠TIEG基因siRNA慢病毒载体psiRNA-TIEG。
- 叶礼红舒晓春邬伟民鲁红云孟晓军孙辽
- 关键词：RNA干扰慢病毒载体
- Smad7对AGEs介导肾小管上皮细胞转分化的影响
- 2008年
- 目的探讨Smad7对终末期糖基化终产物（AGEs）介导大鼠近端肾小管上皮细胞转分化的影响。方法采用Tet-on质粒系统构建强力霉素（Dox）调控Smad7表达的NRK52E株。转染的NRK52E细胞根据刺激条件不同分为（1）Dox-组：单纯AGEs刺激；（2）Dox＋组：AGEs＋Dox刺激。采用细胞免疫化学方法检测p-Smad2／3核表达水平，Western blot方法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和E-钙粘着糖蛋白（E-cadherin）蛋白表达。结果Dox调控Smad7表达的NRK52E细胞株构建成功。Dox可进一步上调AGEs介导的Smad7 mRNA和蛋白表达（t=3．05。P〈0．01）。Smad7高表达可抑制AGEs介导NRK52E细胞30min和24h P-Smad2／3核表达水平（t=4．5，t=3．2，P〈0，01）。明显下调α-SMA和上调E-Cadherin蛋白表达（t=3．47，t=3．25。P〈0．01）。结论Smad7通过抑制Smad信号通路活化，阻抑AGEs介导的肾小管上皮细胞向肌成纤维母细胞转分化。
- 孙辽
- 关键词：DNA结合蛋白质类糖基化终产物肾小管
- TIEGsiRNA对AGEs介导肾小管上皮细胞PAI-1表达的影响被引量：1
- 2011年
- 目的观察TIEG基因沉默对AGEs介导肾小管上皮细胞PAI-1表达的影响。方法以pshRNA-copGFP-lentivector作为载体,构建含有TIEG基因的慢病毒载体psiRNA-TIEG,转染至正常大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E),然后给予AGEs刺激24 h和48 h,采用Western blot方法测定PAI-1蛋白的表达水平。结果 AGEs以时间依赖方式上调NRK52E细胞TIEG mRNA和PAI-1蛋白表达。TGF-β1中和抗体可有效降低AGEs刺激NRK52E细胞48 h后PAI-1的表达水平(1.150±0.089vs0.707±0.015,P<0.05)。TIEGsiRNA转染后可显著下调AGEs刺激NRK52E细胞48 h后TIEG mRNA表达水平(0.852±0.019vs0.448±0.028,P<0.01),及PAI-1蛋白表达水平(0.396±0.042vs0.245±0.063,P<0.05)。结论 TIEG基因沉默能有效抑制AGEs诱导NRK52E细胞PAI-1的表达。
- 孟晓军舒晓春曾映娟文江华胡芳杨琼张瑜叶礼红孙辽
- 关键词：肾小管上皮细胞
- 沉默转化生长因子β诱导基因对糖尿病大鼠肾组织内Smad2、P-smad2及Ⅳ型胶原表达的影响被引量：5
- 2010年
- 目的 探讨沉默转化生长因子β诱导基因（TIEG-siRNA）对糖尿病大鼠肾组织Smad2、p-shred2及Ⅳ型胶原表达的影响.方法 链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型10只,分为空载体组和TIEG-siRNA治疗组,另以5只正常大鼠作为对照组.治疗组和空载体组分别给予TIEG-siRNA病毒液和空载体质粒0.5 ml,于0、72 h两次尾静脉注射,于成模后4周处死.实时荧光定量PCR检测大鼠肾组织内TIEG-mRNA的表达水平,免疫组织化学检测肾组织Smad2、p-smad2、Ⅳ型胶原蛋白表达.Western印迹检测大鼠肾组织Smad2,p-smad2蛋白表达水平.结果 TIEG-mRNA表达在TIEG-siRNA 治疗组（0.0636±0.0066）较空载体组（0.1054±0.0111）明显下调（P〈0.05）,免疫组化半定量结果示Smad2蛋白表达在治疗组[（2.13±0.19）%]较空载体组[（2.53±0.34）%]明显减少（P〈0.05）,p-smad2蛋白和Ⅳ型胶原表达在TIEG-siRNA治疗组较空载体组明显减少[（21.77±2.00）%比（27.03±2.51）%,（3.67士0.42）%比（4.85±0.43）%,P〈0.05].Western印迹显示Smad2在治疗组比空载体组明显减少（0.32±0.09比0.50±0.04,P〈0.05）.P-smad2在治疗组比空载体组明显减少（0.16±0.01比0.32±0.02,P〈0.05）.结论 TIEG-siRNA可以通过影响糖尿病大鼠肾脏内Smad2表达及其活化,从而下调Ⅳ型胶原表达来延缓糖尿病纤维化进程.
- 舒晓春尹代婵叶礼红胡芳文江华杨琼孙辽
- 关键词：糖尿病肾病转化生长因子Β
- 晚期糖基化终产物对肾小球系膜细胞表达Fractalkine的诱导作用被引量：8
- 2007年
- 目的探讨晚期糖基化终产物(AGE)对肾小球系膜细胞表达Fractalkine(Fkn)的影响。方法体外培养大鼠肾小球系膜细胞,实验设AGE组:加入AGE-BSA(100mg·L-1);对照组:加入牛血清清蛋白(BSA)(100mg·L-1);PDTC组:先加入PDTC100μmol·L-1孵育1h,再加入AGE-BSA(100mg·L-1);AGE抗体组:先加入抗AGE抗体(100mg·L-1IgG)孵育2h后,再加入AGE-BSA(100mg·L-1)。培养所需时间收集细胞,检测FknmRNA及蛋白表达,激光共聚焦显微镜检测NF-κB活化。结果AGE诱导体外培养的大鼠系膜细胞大量表达Fkn-mRNA及蛋白,PDTC和AGE抗体显著抑制AGE诱导系膜细胞表达FknmRNA及蛋白。经AGE刺激后NF-κB/P65迅速核转位,30min达高峰。结论AGE通过活化NF-κB诱导肾小球系膜细胞表达Fkn。
- 王碧飞孙辽刘恩波李红晖唐平杨京新
- 关键词：晚期糖基化终产物肾小球系膜细胞糖尿病肾病FRACTALKINE
- 高糖通过转化生长因子依赖途径介导肾小管上皮细胞-肌纤维母细胞转分化及Ⅰ型胶原合成的机制
- 2009年
- 目的探讨高糖介导肾小管上皮细胞转分化及Ⅰ型胶原(Collagen Ⅰ)合成的分子机制。方法含35mmol/L葡萄糖培养液培养大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E细胞),免疫化学方法检测p-Smad2/3核转位,ELISA检测细胞培养上清中TGF-β_1浓度,RT-PCR和Western blot方法分别检测α-SMA、E-cadherin、CollagenⅠ mRNA和蛋白的表达。观察TGF-β_1中和抗体对高糖上述效应的影响。结果高糖促进NRK52E细胞合成和分泌TGF-β_1。TGF-β_1中和抗体能抑制高糖介导的p-Smad2/3核转位,下调高糖介导的α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达,上调E-Cadherin蛋白表达(P均<0.01)。结论高糖介导的肾小管上皮细胞转分化和细胞外基质Collagen Ⅰ的合成依赖于TGF-β_1效应。
- 孙辽孙惠力李晓艳王向阳孙艳艳余学清
- 关键词：转化生长因子Β转分化
- 基因转染Smad7对高糖介导大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响
- 2008年
- 目的探讨Smad7对高糖介导肾小管上皮细胞转分化的影响。方法体外培养转染Smad7的大鼠近端肾小管上皮细胞株(NRK52E细胞),分为强力霉素(Dox)诱导组和未加强力霉素的对照组,前者予Dox诱导24 h后,给予高糖刺激,后者不加Dox诱导。采用免疫细胞化学方法检测p-Smad2/3核转位情况;Western blot方法检测Smad7、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏素(E-cadherin)蛋白的表达水平。结果成功构建了Dox调控的可上调表达Smad7的NRK52E细胞。NRK52E细胞在基础状态下可表达低水平p-Smad2/3(16.1%),与对照组比较,上调表达Smad7显著抑制高糖介导的NRK52E细胞p-Smad2/3核转位(30.3% vs 58.5%,P<0.01)。抑制α- SMA蛋白的表达,逆转高糖介导的NRK52E细胞E-Cadherin蛋白的下调表达。结论基因转染上调表达Smad7可通过抑制Smad2/3的活化和核转位而阻抑高糖介导的肾小管上皮细胞转分化。
- 孙辽
- 关键词：SMAD蛋白上皮细胞转分化
- 高糖通过TGF-β1／Smad信号通路介导肾小管上皮细胞1型胶原合成的机制探讨
- 2008年
- 目的探讨高糖对肾小管上皮细胞Ⅰ型胶原（Collagen Ⅰ）合成影响的分子机制。方法体外培养的大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK52E细胞）分为四组：甘露醇组、高糖组、高糖＋TGF-β1中和抗体组、高糖＋IgG1对照组。ELISA法检测细胞培养上清中TGF-β1的浓度，细胞免疫化学方法检测p-Smad2／3核表达水平，RT—PCR和Western blot方法分别检测CollagenⅠmRNA和蛋白的表达。结果高糖以时间依赖方式上调CollagenⅠmRNA表达。高糖刺激NRK52E细胞24h和48h后内源性TGF-β1合成明显增加，约为甘露醇对照组的3倍。与刺激前和甘露醇组比较，高糖刺激24h可显著上调NRK52E细胞p-Smad2／3核表达水平（t=4．2，t=3．25，P〈0．01）。TGF—β1中和抗体能抑制高糖介导的p-Smad2／3核表达及CollagenⅠ蛋白的表达（t=3．12，t=3．02，P〈0．01）。结论高糖通过TGF-β／Smad信号通路介导肾小管上皮细胞CollagenⅠ的合成。
- 孙辽
- 关键词：转化生长因子ΒDNA结合蛋白质类肾小管
- TIEG特异siRNA对糖基化终末产物介导的肾小管上皮细胞Smad2表达的影响被引量：1
- 2010年
- 目的以RNA干扰技术沉默TGF-β诱导早期基因(TIEG)的表达,观察TIEG沉默对糖基化终末产物(AGEs)介导的肾小管上皮细胞Smad2表达的影响。方法以pshRNA-copGFP-lentivector作为载体,构建含TIEG特异siRNA的慢病毒载体psiRNA-TIEG,将其转染至大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E),然后给予糖基化修饰的牛血清白蛋白(AGE-BSA)刺激24h和48h,采用PCR方法测定其TIEG mRNA、Smad2 mRNA表达水平,蛋白免疫印迹法测定Smad2蛋白表达水平。以转染空质粒载体组作为对照。结果TIEG特异的siRNA可有效下调AGEs诱导的TIEG mRNA、Smad2 mRNA和蛋白表达,与空质粒载体组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论TIEG的沉默能有效抑制AGEs介导的NRK52E细胞Smad2 mRNA和蛋白的表达。
- 叶礼红舒晓春鲁红云胡芳孙辽肖海鹏
- 关键词：肾小管上皮细胞SMAD2慢病毒载体
- 培哚普利对糖尿病肾病肾组织清道夫受体A基因表达的影响
- 2011年
- 目的 研究清道夫受体A（scavenger receptor A,SR-A）基因在糖尿病大鼠肾组织中的表达及血管紧张素转换酶抑制剂-培哚普利的干预作用.方法 将大鼠随机分为正常对照组,糖尿病组和ACEI干预组,采用一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ,60 mg/kg）的方法 建立糖尿病模型,ACEI干预组以培哚普利4mg/（kg·d）灌胃24周.检测各组大鼠的血糖和24 h尿白蛋白,行HE及Masson染色观察肾脏形态学变化,免疫组织化学检测肾小球和小管间质中CD68阳性的巨噬细胞,荧光实时定量PCR测定肾组织中SR-A mRNA表达水平.结果 与对照组相比,糖尿病组大鼠血糖和24 h尿白蛋白均显著上升[（5.3±0.6）mmol/L vs（26.7±3.3）mmol/L;（2.7±1.3）mg/24 h vs（26.7±1.8）mg/24 h;P＜0.05];细胞外基质增多,部分肾小管上皮细胞萎缩、空泡样变性;肾小球和小管间质CD68阳性的巨噬细胞数及肾组织SR-A mRNA的表达均显著上调[（0.77±0.24）个gcsvs（2.55±0.46）个/gcs;（6.13±0.50）个/HPF vs（11.9±2.12）个/HPF,5.6±1.2 vs 1.5±0.2,P＜0.05].ACEI干预后,上述指标除血糖外均被明显抑制[[（3.6±1.4）mg/24h;（1.03±0.37）/gcs;（8.28±1.19）/HPF;3.4±0.7,P＜0.05].结论 ACEI对糖尿病大鼠肾脏有保护作用,其机制可能部分与下调肾组织SR-A表达有关.
- 文江华舒晓春孟晓军胡芳尹代婵杨琼曾映娟孙辽
