福建省卫生厅医学创新课题(2007-CX-15)
- 作品数：7 被引量：17H指数：3
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- 增强型绿色荧光蛋白和大鼠血管生长素-1基因共表达的重组慢病毒体外转染大鼠骨髓间充质干细胞
- 2009年
- 目的:观察共表达的血管生成素-1(Ang-1)基因和增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组慢病毒体外转染大鼠骨髓间充质干细胞(rMSC).方法:体外包装Ang-1基因和EGFP基因共表达的重组慢病毒,测定病毒滴度.转染rMSCs,荧光显微镜下观察EGFP的表达、转导效率,实时荧光定量PCR,Western blot分别在不同时间点行Ang-1基因mRNA以及蛋白表达的相对定量分析.将转染的rMSCs(Ang-1-rMSCs)与对照组rMSCs培养48 h的上清液分别与人脐带静脉内皮细胞(HUVECs)共培养,MTT法检测HUVECs的吸光度值.结果:包装的浓缩慢病毒,滴度为6.1×1010TU/L.转染rMSCs,5 d转染效率为(92.7±3.01)%;实时荧光定量PCR和Western Blot结果显示Ang-1-rMSCs中Ang-1基因mRNA及蛋白表达水平均以转染后3～7 d为高峰,随后开始呈缓慢下降趋势.Ang-1-rMSCs与HUVECs共培养,与对照组rMSCs比较,MTT法检测显示Ang-1-rMSCs能明显促进HUVECs的增殖(P<0.01).结论:在体外重组的慢病毒成功转染rM-SCs,其Ang-1基因表达以转染后3～7 d为高峰,且转染的rMSCs具有Ang-1基因的生物学活性.
- 张阳张志坚陈柏龄陈东平吴秀丽
- 关键词：ANG-1慢病毒转染
- 携带大鼠酪氨酸羟化酶基因慢病毒载体的构建及转染被引量：1
- 2009年
- 目的：构建携带增强绿色荧光蛋白（EGFP）和大鼠酪氨酸羟化酶（TH）基因的慢病毒载体，转染大鼠骨髓间充质干细胞（rMSC），观察TH基因的表达。方法：RT-PCR方法获得大鼠TH基因，将其克隆至慢病毒载体。通过瞬时转染法包装出病毒上清，鉴定滴度。感染rMSCs，荧光显微镜下观察EGFP的表达、转染效率，RT-PCR、免疫印迹法分别检测THmRNA和蛋白的表达情况。结果：重组慢病毒载体质粒pNL-TH—IRES2-EGFP经双酶切鉴定正确，所获TH基因经测序后与GenBank报道序列完全一致；生产的病毒浓缩后滴度为4．1×10^7TU／ml；感染rMSCs结果显示荧光激发可见绿色荧光，TH-rMSCs、空载体-rMSCs组5d转染效率差异无统计学意义。RT-PCR、免疫印迹法显示TH基因成功在rMSCs中表达。结论：成功构建带有EGFP和大鼠TH基因的慢病毒载体，并获得THrMSCs基因工程细胞。
- 张阳张志坚郑明辉陈东平吴秀丽
- 关键词：酪氨酸羟化酶慢病毒载体基因克隆骨髓间充质干细胞转染
- 慢病毒介导的新型Tet-On系统大鼠GDNF和TH双基因脑内转移对帕金森病大鼠模型的保护作用被引量：3
- 2011年
- 目的探讨慢病毒介导的新型Tet-On系统大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因和酪氨酸羟化酶(TH)双基因直接转移对帕金森病(PD)大鼠的保护作用。方法将携带TH、GDNF基因并含启动子为Palb的四环素应答元件的慢病毒(Lv-TH-GDNF)和四环素反式作用子rtTA2s-M2病毒共同注射到SD大鼠左侧纹状体,用强力霉素(DOX)诱导大鼠目的基因GDNF和TH的表达。1周后在大鼠的同侧纹状体注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)损毁纹状体的DA能神经元。通过旋转行为、黑质TH免疫组化染色以及高效液相色谱-电化学方法(HPLC-ECD)检测纹状体DA含量评估其保护效应;通过RT-PCR、免疫印迹观察Lv-TH-GDNF在脑内的表达。实验与健康对照组、磷酸缓冲液(PBS)对照组进行比较。结果在6-OHDA损伤后4周,Lv-TH-GDNF+rt-TA2s-M2+DOX组大鼠阿扑吗啡诱发的旋转效应均明显低于PBS对照组(P<0.01),损毁侧的的黑质区TH阳性细胞表达强度、纹状体DA含量均明显高于PBS对照组(P<0.01),但二者均低于健康对照组(P<0.01)。RT-PCR、免疫印迹结果显示,与PBS对照组比较,Lv-TH-GDNF+rtTA2s-M2+DOX组大鼠纹状体TH、GDNF基因的表达明显增高(P<0.01)。结论慢病毒介导的新型Tet-On系统大鼠GDNF和TH双基因脑内直接转移,在强力霉素诱导下可减缓6-OHDA诱发的大鼠DA能神经元进行性变性,具有保护作用。
- 张阳张志坚俞晓岚黄志新吴秀丽
- 关键词：胶质细胞源性神经营养因子酪氨酸羟化酶慢病毒帕金森病
- 共表达EGFP和CXCR4的大鼠骨髓间充质干细胞的构建及其迁移能力被引量：1
- 2010年
- 目的构建携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)及CXCR4慢病毒载体,并实现其在大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)中的表达,观察转CXCR4基因后对rMSCs迁移能力的影响。方法 RT-PCR扩增大鼠CXCR4编码区片段,将其插入慢病毒载体质粒PNL-IRES2-EGFP,获得的PNL-CXCR4-IRES2-EGFP与包装及包膜质粒用脂质体法共转染293T细胞,包装生产慢病毒。所获慢病毒转染rMSCs后,用RT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光组织化学和流式细胞术检测转CXCR4基因rMSCs组、转空载体rMSCs组中CXCR4表达情况。利用Transwell方法检测两组rMSCs在SDF-1作用下的迁移能力。结果双酶切和测序证实,PNL-CXCR4-IRES2-EGFP构建正确,转CXCR4基因rMSCs组CXCR4表达明显增多,在SDF-1α作用下迁移能力明显增强。结论成功构建带有EGFP和大鼠CXCR4的慢病毒载体,并获得CXCR4-rMSCs基因工程细胞,为深入研究SDF/CXCR4轴在rMSCs向损伤组织定向迁移中的作用奠定了基础。
- 俞晓岚张志坚吴秀丽黄志新
- 关键词：CXCR4EGFP慢病毒骨髓间充质干细胞
- EGFP和大鼠GDNF基因共表达的慢病毒载体构建及转染大鼠骨髓间充质干细胞被引量：3
- 2009年
- 为了构建携带增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)基因的慢病毒载体,观察GDNF基因大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells,rMSC)的表达,本研究采用RT-PCR(reverse transcription-PCR)方法从P0大鼠小脑组织中扩增出GDNF基因编码区636 bp的片段,通过限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接,将GDNF插入慢病毒转移载体PNL-IRES2-EGFP,构建PNL-GDNF-IRES2-EGFP。在脂质体介导下将构建成功的慢病毒三质粒系统共转染人胚肾细胞系(293T)包装生产慢病毒,测定病毒滴度。感染rMSCs,荧光显微镜下观察EGFP的表达、转导效率,RT-PCR、Western blot方法分别检测GDNF mRNA和蛋白的表达情况。结果显示:GDNF的基因序列经测序后与GeneBank报道的序列完全一致,重组慢病毒载体质粒PNL-GDNF-IRES2-EGFP经双酶切鉴定正确;三质粒共转染293T细胞后荧光激发可见大量绿色荧光,收集、浓缩病毒后测定其滴度为5.3×107pfu/ml;感染rMSCs结果显示:GDNF-rMSCs组5 d转导效率为93.3%±3.17%,传代培养4周,下降到81.1%±3.59%,差异具有统计学意义(P<0.01)。RT-PCR(real time-PCR)、Western blot显示GDNF成功在rMSCs中表达。本结果表明,我们已经成功构建带有EGFP、GDNF基因的慢病毒载体,并获得GDNF-rMSCs基因工程细胞,但提高该工程细胞外源基因的稳定表达技术仍需进一步探讨。
- 张阳张志坚陈东平吴秀丽
- 关键词：GDNF慢病毒载体转染
- 新型Tet-On系统大鼠GDNF和TH双基因的慢病毒载体的构建与表达被引量：7
- 2010年
- 目的采用改良的Tet-On四环素可调控系统,构建携带大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因和酪氨酸羟化酶(TH)双基因的慢病毒载体,观察四环素类抗生素对GDNF、TH基因的表达调控。方法 PCR方法获得大鼠GD-NF、TH基因,将其克隆至改良的Tet-On四环素调控慢病毒载体。通过瞬间转染法包装出病毒上清,用实时荧光定量PCR鉴定滴度。将包装的慢病毒-TH-GDNF与rtTA2S-M2以相同感染复数(MOI)感染293T细胞,实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测强力霉素对GDNF、TH基因mRNA和蛋白的表达调控。结果实验成功构建重组慢病毒载体质粒;生产的病毒浓缩后滴度为2.1×1011TU·L-1;感染293T细胞实时荧光定量PCR和免疫印迹显示强力霉素阳性组可见GDNF、TH基因mRNA表达明显升高(P<0.01)和蛋白条带,阴性组未见。结论在改良的Tet-On调控系统的慢病毒载体上成功克隆大鼠GDNF、TH双基因,其表达受四环素类抗生素调控并未见背景效应。
- 张阳张志坚杨光华俞晓岚黄志新吴秀丽
- 关键词：胶质细胞源性神经营养因子酪氨酸羟化酶慢病毒载体基因克隆
- 过表达Nanog基因的小鼠骨髓间质干细胞对NF-κB表达的影响被引量：2
- 2010年
- 核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)的激活被认为与中枢神经系统变性疾病的进展有关。新近报告Nanog能抑制NF-κB的表达,为验证这一发现,通过限制性内切酶酶切和基因重组的方法,构建携带Nanog基因的重组慢病毒表达载体质粒pNL-Nanog-IRES2-EGFP,经PCR检测以及测序鉴定后,在脂质体介导下与包装质粒HELPER、包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒。所获慢病毒感染小鼠骨髓间充质干细胞(mMSCs)后,Western blotting法检测在mMSCs中Nanog基因的表达,PCR、Western blotting和免疫细胞化学法检测NF-κB基因的表达。结果显示所克隆的Nanog基因测序结果与GenBank报道序列完全一致。构建的慢病毒载体质粒PNL-Nanog-IRES2-EGFP经SalI和BamHI双酶切后电泳鉴定正确。所获慢病毒感染mMSCs后荧光激发mMSCs可见绿色荧光,Western blotting检测显示Nanog-mMSCs组表达Nanog,其他两组基本不表达。RT-PCR和Western blotting检测显示Nanog-mMSCs组的NF-κB表达较空载体-mMSCs组及mMSCs组低,差异有显著性意义。构建携带Nanog基因慢病毒载体并在小鼠骨髓间质干细胞中成功表达,Nanog基因的表达可抑制NF-κB表达,这结果为神经变性疾病的治疗提供了新思路。
- 黄志新张志坚张阳俞晓岚吴秀丽
- 关键词：NANOGNF-ΚB慢病毒载体
