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抗新生血管蛋白KBP多克隆抗体的制备及鉴定被引量：2: 2011年; 目的激肽释放酶结合蛋白(Kallikrein-binding protein,KBP)具有抑制血管新生的高活性,但目前尚无KBP的特异性抗体,限制其进一步研究。本研究拟制备高灵敏度和高特异性的KBP抗体并对其进行初步评估。方法构建含大鼠源性KBP序列的pET-28a重组载体的大肠杆菌BL21(DE3),在此基础上,扩增表达菌,经异丙基B.D一硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Ni-NTA色谱柱亲和层析纯化获得KBP重组蛋白。利用SDS-PAGE和Western blot方法对KBP进行鉴定。以纯化产物为抗原免疫新西兰大白兔,获得兔抗KBP血清,亲和纯化获得多克隆抗体。应用Elisa和Western-blot方法检测纯化抗体的效价和特异性。结果 KBP融合蛋白得到高表达,且纯度大于85%。用该融合蛋白免疫大白兔后得到的抗KBP抗体,效价达1∶512 000,并特异性识别大鼠和人组织中天然的KBP蛋白。结论以纯化的KBP重组蛋白为抗原,获得KBP多克隆抗体,具有较好的效价和特异性,为KBP功能和作用机制的深入研究提供了必要的工具。; 陈易斐黄莉钧李磊戴智育程锐杨霞高国全; 关键词：多克隆抗体制备

一种高选择性、高效的牛视网膜微血管内皮细胞培养方法被引量：5: 2012年; 目的建立一种高效、可行、特异性高的牛视网膜微血管内皮细胞(BREC)培养方法。方法取新鲜牛眼,分离视网膜并用DMEM进行冲洗、匀浆剪碎,过75μm筛,将滤网上滤渣转移至50ml离心管,用Ⅰ型胶原酶、DNaseⅠ及蛋白酶等多种酶混合液消化20min,人血清中和后,过46μm网筛并冲洗,离心5min,将组织扣在培养皿中,转入15ml离心管,用10%人血清含生长因子ECGS的DMEM培养液培养于25cm2,选择性培养视网膜血管内皮细胞,接种于明胶包被培养瓶中,采用ECGS配合肝素培养液促进内皮细胞生长,观察细胞形状生长特性,并用免疫化学荧光方法进行鉴定。结果选择性培养视网膜微血管内皮细胞成单层、镶嵌铺路石状生长,Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测为阳性纯度均大于95%以上,将细胞种在凝固的基质胶表面,12～18h形成官腔结构。结论本方法过程简单、可靠,培养的内皮细胞纯度高,生长状态良好,稳定传代,为视网膜血管生成疾病研究建立了模型。; 王征齐炜炜陈少波戴智育陈大伟程锐高国全杨霞; 关键词：视网膜微血管内皮细胞细胞培养

具有抗血管新生活性的K5突变体GST-K5M5基因的构建、表达及纯化被引量：1: 2013年; 目的构建可溶性的人纤溶酶原Kringle 5(K5)突变体GST-K5M5基因,并在单位体积的原核系统中获得高表达、高纯度、可水溶的融合GST-K5M5蛋白粉针剂。方法 K5M5突变体基因(模板已经对K5N端5个带负电的酸性氨基酸进行中性氨基酸丝氨酸的中性突变),通过PCR从本实验室保存的pET22b(+)/K5mut5 cDNA模板中扩增得到,再克隆到pGEX-4T-1/BL21(DE3)原核表达系统中。用自动诱导培养系统诱导其表达,提高产量。通过GST树脂亲和层析柱分离,双蒸水透析纯化,再制成冻干粉剂保存。结果该重组GST-K5M5蛋白的分子量为37000Mr,通过SDS-PAGE和Western-blot可以检测到其存在。冻干粉复溶的GST-K5M5呈剂量依赖抑制内皮细胞的增殖。结论在以前的研究基础上设计并用自动诱导培养的方法在大肠杆菌中表达纯化出了GST-K5M5融合蛋白,得到的GST-K5M5蛋白产量高、纯度高、可溶性好、生物学效应强,且方法简便、经济,为工业大规模发酵提供了基本参数。; 黄莉钧石丁波姚亚超李磊戴智育张婷高国全杨霞; 关键词：冻干粉

海洋微生物次级代谢产物1403-B的抗胃癌活性被引量：1: 2012年; 目的筛选能被海洋微生物次级代谢产物1403-B显著抑制的肿瘤细胞,初步探讨其机制,为临床抗肿瘤提供候选药物。方法用2.5、5.0、10、20、40μmol/L 1403-B分别处理鼻咽癌细胞株(3种:HONE-1、CNE-2、5-8F),肝癌细胞株(2种:HepG2、Bel7402),胃癌细胞株(SGC7901)48 h后,MTT法检测细胞增殖的情况;荧光显微镜观察细胞形态学变化;用Annexin V/PI双染法分析其凋亡情况,Western印迹法检测caspase-3的切割。结果 MTT实验显示,1403-B呈浓度依赖性抑制多种肿瘤细胞的增殖(P<0.05),其中对胃癌细胞SGC7901的IC50最低,为(4.12±0.57)μmol/L。1403-B作用SGC7901细胞24 h后,出现细胞膜、细胞核皱缩,染色质浓集和形成包裹细胞核片段的凋亡小体等凋亡现象,且呈剂量依赖性增加。Annexin V/PI双染法显示,随着1403-B浓度增加,SGC7901凋亡率升高。1403-B促进SGC7901细胞caspase-3切割。结论海洋药物1403-B能够通过诱导SGC7901凋亡而显著抑制其增殖,有望成为一种抗胃癌的新药物。; 叶芳段君婷程锐廖峭张洋杨霞高国全王继红; 关键词：海洋微生物凋亡 SGC7901 CASPASE-3

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