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多房棘球绦虫原头蚴对体外培养宿主肝细胞MAPK信号通路影响的初步研究被引量：6: 2011年; 目的探讨多房棘球绦虫原头蚴对体外培养宿主肝细胞丝裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号通路的影响。方法采用宿主大鼠肝细胞BRL3A和人源肝癌细胞系HepG2,分别与多房棘球绦虫原头蚴体外无血清共培养。实验组(与多房棘球绦虫原头蚴共培养)每瓶细胞接种约3×103个原头蚴;处理组(U0126)每瓶细胞先用20μmol/L U0126处理3 h,再接种约3×103个原头蚴,继续共培养,分别在12、24、48、72、96和120 h收集细胞,同时收集对照组(无血清培养基)细胞。利用免疫印迹技术(Western blot)检测p-ERK1/2、p-p38和p-JNK的变化。结果在48 h,肝细胞BRL3A共培养组p-ERK1/2表达活性与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),在12、24和48 h,p-JNK和p-p38表达活性分别有微弱升高;在72和96 h肝细胞HepG2共培养组p-ERK1/2表达活性与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),p-JNK和p-p38表达活性无明显变化;U0126处理组p-ERK1/2活性受抑制。结论多房棘球绦虫原头蚴可能自身分泌细胞因子EmIns、EmBMP1/2、EmAct或egfd,通过与宿主表面受体结合激活宿主肝细胞MAPK信号通路。; 张传山李朝旺范金亮李静吕国栋王俊华卢晓梅温浩林仁勇; 关键词：多房棘球绦虫原头蚴肝细胞 MAPK

细粒棘球蚴SmadA基因的克隆及其功能的初步鉴定被引量：3: 2011年; 本研究旨在克隆细粒棘球蚴Smad蛋白家族基因EgSmadA,鉴定其结构及表达部位,并建立酵母双杂交体系。利用生物信息学方法,克隆及分析EgSmadA基因的DNA全长序列,采用免疫组化技术鉴定EgSmadA蛋白的表达及分布,并构建该基因酵母双杂交载体。结果表明,成功扩增出EgSmadA基因组序列全长4 069bp,包含4个外显子和3个内含子,开放阅读框为957bp,编码318个氨基酸,该蛋白C端含有Smad蛋白家族进化高度保守的典型结构域MH2(Mad homology),并成功构建该基因及其MH2结构域的酵母双杂交载体。免疫组化定位该蛋白主要表达于原头蚴被膜及囊泡生发层。研究结果为进一步研究EgSmadA在细粒棘球蚴生长发育中的作用奠定了基础。; 李静李静张传山吕国栋王俊华魏绪法林仁勇; 关键词：细粒棘球蚴基因克隆酵母双杂交

泡球蚴感染BALB/c小鼠肝脏TGF-β1表达的动态变化被引量：7: 2009年; 目的观察泡球蚴感染BALB/c小鼠肝脏转化生长因子β1(TGF-β1)的动态变化。方法将60只BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,肉眼直视下肝脏穿刺感染泡球蚴。分别于感染后2 d8、d、4周、12周、24周、36周采取小鼠肝脏组织,通过HE和Masson染色观察小鼠肝脏病理改变,免疫组织化学法观察泡球蚴感染不同阶段的TGF-β1动态变化。结果泡球蚴感染小鼠肝脏汇管周围出现炎细胞浸润、脂肪变性、坏死、钙化和肝泡球蚴纤维囊壁形成等多种病理改变;TGF-β1表达水平呈先升高再下降趋势,感染4周、12周、24周、36周时的阳性率分别为(1.44±3.22)%、(18.83±4.03)%(、9.44±4.71)%和(8.13±3.65)%,其中感染12周和36周与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论泡球蚴感染BALB/c小鼠TGF-β1表达上调,可能与感染小鼠肝纤维化的发展有关。; 牵瑶刘辉卢晓梅吕国栋谢文娟王俊华王红丽温浩丁剑冰林仁勇; 关键词：泡球蚴 BALB/C小鼠肝脏 TGF-Β1

实时荧光定量PCR检测多房棘球蚴感染小鼠肝脏丝氨酸蛋白酶抑制基因方法的建立被引量：2: 2009年; 目的建立多房棘球蚴（泡球蚴）感染小鼠肝脏丝氨酸蛋白酶抑制基因（Serpina3g）实时荧光定量PCR（RT—qPCR）的检测方法及与常规RT—PCR检测方法的比较。方法肉眼直视下肝脏穿刺注射100μl泡球蚴组织匀浆液建立泡球蚴感染小鼠模型，3个月后将小鼠处死，Trizol法提取肝脏总RNA，反转录获得cDNA。依据Serpina3g的编码基因（NM_009251）保守序列，通过Primer5软件设计定量引物，以β—actin作为内参。以健康小鼠肝脏获得的cDNA依次10倍梯度稀释制备标准品（1×10^2～1×10^6pg），利用SYBR Green RT-qPCR方法检测Serpina3g基因，然后根据cDNA浓度与循环值（Ct）的线性关系，绘制标准曲线，确定RT—qPCR检测的最佳条件和重复性；并将RT—qPCR结果与常规RT—PCR琼脂糖凝胶电泳结果进行特异性、灵敏度和定量等方面的比较。结果筛选出Serpina3g基因定量引物，最佳退火温度为56．g℃；RT—qPCR无非特异性扩增，标准品及样品熔解温度均在80．5℃，熔解峰单一；标准曲线斜率为-2．833（效率），相关系数r=0．996：5个不同梯度的样本（1×10^2～1×10^6pg）重复检测5次均为阳性，变异〈5％；mRNA检出限为1×10^2pg，总RNA在1×10^2-1×10^6pg内均可以进行扩增；常规RT-PCR方法mRNA检出限仅为1×10^6pg。结论成功建立了小鼠源Serpina3g的RT—qPCR检测方法，在特异性、灵敏度、重复性和定量方面优于常规RT—PCR。; 王俊华刘涛王慧吕国栋卢晓梅王星姜涛温浩林仁勇

Fas及Caspase家族在泡球蚴感染宿主肝脏中的表达及其意义被引量：3: 2011年; 目的探讨细胞凋亡信号分子Fas及Caspase家族在肝泡球蚴病宿主中的表达及意义。方法16例配对泡型包虫患者（AE）肝脏标本，16只雌性BALB／C小鼠。分析肝脏标本中肝细胞病理变化、凋亡及Fas、Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9的表达。结果AE患者病灶周围肝细胞水肿，汇管区周围纤维化，肝细胞造型坏死；病灶周围肝细胞发生显著凋亡[（74．0±15．0）％比（4．2±3．3）％]，Fas[（71．3±19．0）％比（5．2±1．6）％]、Caspase-3[（39．4±18．3）％比（3．3±2．9）％]、Caspase-8[（37．6±3．5）％比（4．0±1．8）％]和Caspase-9[（24．7±13．8）％比（2．0±1．4）％]高表达（P〈0．05）。泡球蚴感染小鼠病灶处可见囊泡，肝组织纤维化严重；肝细胞发生显著凋亡[（37．5±5．2）％比（13．9±2．7）％]，Fas[（48．3±6．2）％比（4．6±1．2）％]、Caspase-3[（29．7±6．3）％比（5．2±1．9）％]、Caspase-8[（23．1±2．9）％比（3．5±1．4）％]和Caspase-9[（16．7±3．2）％比（2．3±1．1）％]高表达（P〈0．05）。结论泡球蚴感染引起宿主肝细胞凋亡，提示Fas及Caspase家族介导的细胞凋亡信号通路可能参与了泡球蚴所致肝损伤进程。; 王俊华张传山张雪卢晓梅温浩林仁勇; 关键词：泡球蚴病 FAS CASPASES

泡球蚴感染对BALB/c小鼠肝细胞ERK1/2和p38表达变化的初步研究被引量：5: 2009年; 目的通过检测ERK1/2和p38在泡球蚴感染小鼠肝组织中的表达,探讨其在肝泡球蚴病发生中的作用。方法采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫组织化学的方法检测16例感染组小鼠和16例对照组小鼠肝组织中的ERK1/2和p38的表达水平。结果感染组ERK1/2表达水平较对照组有统计学差异(P<0.05),p38的表达在感染组与对照组无统计学差异。结论在泡球蚴感染早期,肝细胞增殖占主导。; 纪静王俊华姜涛吕国栋刘辉李瑶王红丽卢晓梅王星段新宇温浩买买提祖农林仁勇; 关键词：泡球蚴 ERK1/2 P38 小鼠

细粒棘球蚴囊液对HepG2细胞增殖的影响: 2012年; 目的探讨细粒棘球蚴囊液（HCF）对宿主肝细胞丝裂原活化蛋白激酶信号通路及细胞周期的影响。方法四甲基偶氮唑盐法检测不同浓度HCF对HepG2细胞的增殖作用。流式细胞仪检测细胞周期。Western blot法检测磷酸化细胞外信号调节激酶（P-ERK）、增殖细胞核抗原（PCNA）、细胞周期蛋白（cyclin）D1、cyclin A、cyclin B1、cyclin E的表达水平。对数据采用重复测量方差分析。结果在48、72h和96h，15％、30％和60％HCF组与无胎牛血清比较，能明显促进HepG2细胞的增殖护值均〈0．05）。Westem blot检测结果显示：15％HCF组p-ERK在48h高表达（F=1．916，P〈0．01），cyclin D1在24h高表达旷=3．901，P〈0．01），15％、30％HCF组PCNA分别在48h、72h高表达（F=91．140，P〈0．01），cyclinA分别在48h、72h高表达旷=18．587，P〈0．01），cyclinB1分别在48h、72h高表达（F=2．064，P〈0．01），30％HCF组cyclinE在96h高表达（F=1．068，P〈0．01）。结论HCF对体外培养的HepG2细胞无毒害作用，对其增殖有一定促进作用。; 李朝旺赵晋明张传山吕国栋温浩林仁勇; 关键词：肝细胞细胞周期细胞增殖

细粒棘球绦虫DNA聚合酶δ小亚基EgPolD2基因的克隆及序列分析被引量：1: 2012年; 目的从新疆株细粒棘球绦虫原头蚴中克隆DNA聚合酶δ小亚基EgPolD2,进行序列测定和生物信息学分析。方法设计EgPolD2特异性引物,用RT-PCR方法从细粒棘球绦虫原头蚴cDNA中克隆EgPolD2基因,然后将其克隆至pMD18-T载体,测序并进行生物信息学分析,半定量反转录PCR分析其在细粒棘球绦虫原头蚴和囊泡中的表达情况。结果 EgPolD2基因开放阅读框为1 218bp,编码405个氨基酸,等电点为4.74。NCBI保守功能区分析软件预测EgPolD2蛋白第113～378个氨基酸为MPP_PolD2_C结构域。登陆GenBank进行Blast比对,EgPolD2与曼氏血吸虫SmPolD2基因同源性为32.1%,与线虫和人等其他物种PolD2基因同源性在18.3%～22.8%之间。进化树分析表明EgPolD2与SmPolD2相聚集,与其他物种同源性较低。半定量RT-PCR显示,EgPolD2在细粒棘球绦虫原头蚴和囊泡中均有表达,且表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论本实验成功克隆出细粒棘球绦虫EgPolD2新基因,为进一步研究抗细粒棘球绦虫药物靶标奠定了基础。; 吕国栋叶建蔚张传山王俊华李亮温浩林仁勇; 关键词：细粒棘球绦虫

泡球蚴感染中期小鼠肝脏病灶周围肉芽肿TGF-β1及其受体TβRⅠ和p-Smad2/3的表达及意义被引量：9: 2010年; 目的观察泡球蚴感染中期BALB/c小鼠病灶周围肉芽肿中转化生长因子（TGF-β1）及其Ⅰ型受体（TβRⅠ）和p-Smad2/3蛋白的表达及意义。方法 8~10周龄雌性BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组。将BALB/c小鼠开腹,肉眼直视下肝左叶注射100μl泡球蚴混悬液,建立小鼠肝泡球蚴感染模型,对照组以相同方法注射等量的生理盐水。于造模第12周时处死小鼠,取肝脏组织,4%甲醛固定、石蜡包埋,4μm连续切片,HE和Masson染色,光镜下观察泡球蚴感染病灶周围病理改变和纤维化程度,采用免疫组织化学技术检测肉芽肿TGF-β1、TβRⅠ受体及p-Smad2/3蛋白的表达。结果实验组小鼠病灶周围以形成典型的大小和形状各异的囊泡为主要特征,囊泡外周纤维结缔组织增生明显,存在不同程度的纤维化。囊泡外围肉芽肿TGF-β1、TβRI和p-Smad2/3的显色指数分别为3.90±1.39、3.18±0.95和3.60±0.93,对照组分别为0.28±0.18、0.32±0.18和0.20±0.14,差异均有统计学意义（P均〈0.01）。结论囊泡外围组织纤维化较重部位TGF-β1、TβRI和p-Smad2/3表达也相应较高,提示TGFβ1/Smad信号通路可能参与泡球蚴感染小鼠病灶纤维化过程。; 魏绪法邵英梅王俊华李瑶张传山刘辉姜涛卢晓梅温浩林仁勇; 关键词：泡球蚴肉芽肿 TGF-Β1

细粒棘球蚴细胞外信号调节激酶基因克隆、序列分析及功能的初步鉴定被引量：6: 2010年; 目的从新疆株细粒棘球蚴中克隆细胞外信号调节激酶（EgERK1）基因，进行序列测定、生物信息学分析，蛋白表达及功能初步鉴定。方法设计特异性引物，从新疆株细粒棘球蚴中提取总RNA，RT—PCR法扩增EgERKl基因，构建pET28a—EgERK1原核表达质粒，测序确定序列并进行生物信息学分析。构建正确的pET28a-EgERK1原核表达质粒，经诱导、表达EgERK1重组蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹检测其生物学功能。结果RT-PCR扩增出的条带经测序，结果显示其长度为1125bp，编码374个氨基酸，等电点为6．34，BLAST比对结果提示为一新基因，命名为EgERKl（EU701008）。同源性比较表明，EgERK1与多房棘球绦虫ERK基因（EmMPK1）同源性为95．45％，与线虫、酵母、果蝇和人类等ERK基因的同源性为43．04％～61．88％。进化树分析发现EgERKl和EmMPKl相聚集。功能分析预测EgERKl具有ERK类激酶T—X—Y结构保守区和酶激活功能域。Western印迹显示，原核诱导表达的EgERKl重组蛋白能与抗人ERK1／2抗体发生特异性免疫反应。结论成功克隆细粒棘球蚴EgERKl新基因，发现EgERK1重组蛋白具有与ERK1／2抗体结合的功能，为进一步研究该基因在寄生虫与宿主相互作用中的功能奠定基础。; 吕国栋纪静王俊华李亮王红丽卢晓梅王星温浩林仁勇; 关键词：细粒棘球绦虫细胞外信号调节MAP激酶类基因克隆质粒

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