国家自然科学基金(30900470C090301)
- 作品数：2 被引量：2H指数：1
- 相关作者：周东曾天芳陈蕾李耀华更多>>
- 相关机构：四川大学华西医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 靶向大鼠HIF-1α的RNAi慢病毒载体的构建及鉴定被引量：1
- 2012年
- 目的构建靶向HIF-1α的RNAi慢病毒载体,为进一步观察其对难治性癫痫大鼠模型脑内HIF1α基因过度表达的干扰作用奠定基础。方法根据GenBank报道的大鼠HIF-1α基因序列,选择4个靶序列,设计并合成4对含编码短发夹RNA(shRNA)序列的寡核苷酸,双链退火后,插入经限制性内切酶Age I和EcoR I处理所得的线性化慢病毒载体pGCSIL-GFP(表达绿色荧光蛋白,GFP)的U6启动子下游,合成4种重组病毒pGCSIL-GFP-shRNA1,2,3,4,经酶切和测序鉴定构建正确后,分别与Lipofectamine 2000共转染293T细胞包装,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液浓缩后得到高滴度的慢病毒液,孔稀释法测定病毒滴度。采用同样方法构建阴性对照重组慢病毒。结果酶切和测序分析证实成功构建了靶向大鼠HIF-1α的慢病毒表达载体4对,滴度为(5～7)×108 TU/ml。结论本实验成功构建了针对大鼠HIF-1α基因的RNAi慢病毒载体,为实现在细胞和动物模型以慢病毒为载体的HIF-1α靶向治疗提供了良好的实验基础。
- 陈蕾曾天芳周东李耀华
- 关键词：RNA干扰HIF-1Α慢病毒
- 低氧诱导因子-1α与马桑内酯点燃SD大鼠难治性颞叶癫痫耐药模型耐药性的相关性研究被引量：1
- 2012年
- 目的探讨难治性颞叶癫痫中低氧诱导因子-1α（HIF-1α）在不同脑区表达水平的变化及其与耐药蛋白MDR1/Pgp表达的关系。方法以SD大鼠作为研究对象,设置点燃组和对照组。点燃组处理方法：以马桑内酯（CL） 0.4ml/kg肌注,1次/72h,在给药1~5次期间判定点燃模型是否构建成功,选择符合标准的大鼠继续给药,1次/6d,共30次;最后点燃组共存留7只大鼠。对照组5只大鼠,在同时间点给予0.4ml/kg生理盐水肌注。取大鼠脑组织标本,制备后采用实时荧光定量PCR（RQ-PCR）、免疫组织化学（IHC）和Western blotting三种方法分别检测HIF-1α、MDR1/Pgp在脑组织中的表达情况。结果 IHC显示,HIF-1α在点燃组主要表达于大鼠海马、颞叶皮质等部位的神经元和神经胶质细胞,在对照组仅见微弱表达。Pgp的分布及表达情况与HIF-1α一致。RQ-PCR显示,点燃组HIF-1α mRNA在海马中的表达为对照组的1.741倍,在颞叶中的表达是对照组的1.395倍。Pgp mRNA在海马及颞叶的表达分别为对照组的2.297倍和1.474倍。Western blotting显示,点燃组海马HIF-1α蛋白表达（1.284±0.166）较对照组（0.763±0.117）明显增高（P〈0.05）,且点燃组颞叶皮质中HIF-1α蛋白（1.350±0.105）亦较对照组（0.941±0.078）明显增高（P〈0.05）。Pgp的表达与HIF-1α表达呈一致变化,即点燃组海马和颞叶中Pgp的表达（0.831±0.086,0.919±0.129）较对照组（0.441±0.053,0.643±0.095）明显增高（P〈0.05）。另外,点燃组Pgp蛋白和mRNA在海马中的表达较颞叶高（P〈0.05）。结论 HIF-1α在大鼠颞叶癫痫耐药模型的海马和颞叶皮质中的表达较正常大鼠高,且与Pgp表达的空间分布一致。HIF-1α与Pgp表达的相关性提示HIF-1α可能与难治性颞叶癫痫的耐药性相关。
- 陈蕾李耀华曾天芳周东
- 关键词：低氧诱导因子-1P糖蛋白SPRAGUE-DAWLEY大鼠马桑内酯
