国家自然科学基金(81170267)
- 作品数：5 被引量：12H指数：2
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- 人β-COP-shRNA慢病毒载体构建及干扰效应检测被引量：1
- 2015年
- 目的采用常规转染试剂难以将人β-COP-shRNA转染至THP-1细胞。构建人β-COP特异性的shRNA慢病毒载体,并测定其对靶基因β-COP的抑制效应。方法设计合成针对人β-COP基因靶点特异的4对shRNA寡聚单链DNA,插入p GMLV-SC1载体中,构建慢病毒重组载体。将重组载体和包装质粒共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒并测定滴度。用慢病毒感染THP-1细胞,定量PCR和Western blot检测干扰载体对β-COP基因的干扰效果。结果测序证实,β-COP基因的shRNA寡聚核苷酸序列已插入慢病毒载体,转染HEK 293T细胞,经包装得到4种慢病毒,病毒滴度为1×109TU/m L。定量PCR分析显示,4种β-COP-shRNA慢病毒感染的THP-1细胞中β-COP基因mRNA表达量分别为0.831±0.065、0.675±0.079、0.260±0.050、0.497±0.067,较对照(1.000±0.000)明显升高(P<0.01);其抑制率分别为16.9%、32.5%、74.0%和50.3%。Western blot结果表明,4种干扰载体均可抑制β-COP蛋白表达,其中β-COP-shRNA 3的沉默效率为76.4%。结论成功构建了人β-COP-shRNA干扰载体,证实了干扰载体对靶基因有较好的沉默效果。
- 马卫列丁航李观强肖娟张志珍
- 关键词：脂质代谢
- 慢病毒介导磷酸二酯酶7A基因沉默细胞株的构建及三磷酸腺苷结合盒转运体A1的表达变化被引量：1
- 2016年
- 目的利用慢病毒介导构建磷酸二酯酶7A(PDE7A)基因沉默人单核巨噬细胞(THP-1)株,并分析沉默细胞株的三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的表达变化。方法以PDE7A基因为靶点,设计合成3段sh RNA片段,与慢病毒载体Pmi Rzip连接,构建重组质粒。测序鉴定后进行病毒包装,感染THP-1细胞,实时荧光定量聚合酶链反应(q PCR)进行分析,确定最佳干扰片段。嘌呤霉素筛选得到PDE7A基因沉默稳转细胞株。q PCR和Western blot检测鉴定所构建的细胞株,将其诱导成为泡沫细胞后鉴定ABCA1基因的表达。结果转染sh RNA1、sh RNA2、sh RNA3细胞的PDE7A相对表达量分别为(0.480±0.028)、(0.561±0.016)和(0.377±0.013),故选择sh RNA3作为干扰PDE7A基因的最佳片段。采用1.4 g/L嘌呤霉素成功筛选出PDE7A沉默细胞株,q PCR和Western blot检测PDE7A基因的干扰效率,其抑制效率>70%。将其诱导成巨噬泡沫细胞后,Western blot检测显示,ABCA1的表达量增加40%。结论成功构建PDE7A sh RNA慢病毒干扰载体,并筛选出PDE7A基因沉默的THP-1细胞株,且ABCA1的表达量增加。
- 向乐唐菀泽张志珍马卫列
- 关键词：RNA干扰慢病毒三磷酸腺苷结合盒转运体A1
- 磷酸二酯酶7及其抑制剂被引量：7
- 2012年
- 磷酸二酯酶7(phosphodiesterase7,PDE7)作为体内特异性水解第二信使环腺苷一磷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的一类蛋白水解酶,通过调控组织细胞内cAMP水平及机体信号传导活动,参与了体内多种疾病的发生发展过程.PDE7主要分布于前炎症细胞及免疫细胞.最新研究表明,PDE7作为一个新的潜在的抗动脉粥样硬化及抗炎症免疫类药物的新靶点,其抑制剂可能在研究及治疗动脉粥样硬化及慢性阻塞性肺病等免疫炎症类疾病方面具有重要意义.本文简述PDE7基因结构、生物学功能以及其抑制剂研究,并重点就其与疾病之间联系做一综述.
- 饶勇龚晓华马卫列张志珍
- 腺苷酸环化酶对泡沫细胞胆固醇流出的影响
- 2015年
- 目的观察腺苷酸环化酶AC1和AC4对泡沫细胞胆固醇流出的影响。方法以人AC1和AC4基因为靶点,设计合成sh RNA寡核苷酸片段,插入慢病毒载体p GMLV-SC1,构建重组慢病毒载体。用构建的AC-sh RNA慢病毒感染THP-1细胞,q PCR检测干扰载体对AC1和AC4基因的干扰效果。慢病毒感染泡沫细胞后,采用液体闪烁计数法测定apo A-1介导的泡沫细胞胆固醇流出率。结果测序结果表明,AC1和AC4基因的sh RNA寡聚核苷酸序列已成功插入慢病毒载体。荧光观察显示,两种慢病毒的感染效率达80%。q PCR分析表明,AC1-sh RNA和AC4-sh RNA干扰载体对靶基因有明显的抑制效果(P<0.01),其抑制效率分别为83.9%和80.1%。AC1和AC4-sh RNA慢病毒感染泡沫细胞后,胆固醇流出明显降低(P<0.01)。结论本实验初步证实AC1和AC4可降低泡沫细胞胆固醇流出,提示其可能在胆固醇代谢中起作用。
- 丁航唐菀泽向乐马卫列覃燕梅刘慧明张志珍
- 关键词：腺苷酸环化酶泡沫细胞胆固醇
- HPLC法测定apoA-1介导的泡沫细胞胆固醇流出的实验研究被引量：4
- 2015年
- 目的建立用高效液相色谱(HPLC)法测定载脂蛋白A-1(apoA-1)介导的泡沫细胞内胆固醇流出率的实验方法。方法人单核细胞THP-1用160nmol/L佛波酯(PMA)诱导24h分化为贴壁巨噬细胞(PMA组),再用50μg/mL乙酰化低密度脂蛋白(ac-LDL)处理48h,诱导巨噬细胞变成泡沫细胞(ac-LDL组);加入含apoA-1的1640培养基培养24h(apoA-1组)。油红O染色和HPLC法测定细胞内胆固醇水平,鉴定巨噬细胞源性泡沫细胞模型。采用HPLC分析和液体闪烁计数法测定apoA-1介导的泡沫细胞内胆固醇流出率。结果 THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞经油红O染色后,细胞内可明显观察到大量红色脂滴存在。胆固醇水平测定显示,ac-LDL组内游离胆固醇、总胆固醇和胆固醇酯的水平明显高于PMA组(P<0.01)。ac-LDL处理细胞48h后,ac-LDL组内总胆固醇水平为80.25μg/mg细胞蛋白,胆固醇酯水平为47.65μg/mg细胞蛋白,占总胆固醇的59.38%,与PMA组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。HPLC分析和液体闪烁计数法结果表明,apoA-1介导泡沫细胞内apoA-1组胆固醇流出率分别为5.63%和7.08%(P<0.01)。结论本研究成功建立了酶促反应结合HPLC测定泡沫细胞内胆固醇流出的方法,为后续研究细胞脂质代谢提供了实验基础。
- 马卫列龚晓华李观强丁航兰柳波陈小谊张志珍
- 关键词：泡沫细胞载脂蛋白A-1胆固醇流出
