国家科技重大专项(2012ZX10001008)
- 作品数：12 被引量：19H指数：3
- 相关作者：刘颖郝彦玲任莉梁华王书晖更多>>
- 相关机构：中国疾病预防控制中心潍坊医学院北京大学更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项国家重点实验室开放基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- HIV-1 Gag和Env蛋白特异性ADCC反应与AIDS病程进展的关系
- 2014年
- 目的了解艾滋病病毒I型(HIV-1)Gag和Env蛋白特异性抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)反应,与艾滋病(AIDS)疾病进展的相关性。方法采集58份未经抗病毒治疗的、感染时间1年以内的男男性行为人群(MSM)标本,利用HIV-1特异性肽库刺激和流式细胞染色技术进行ADCC检测。结果病毒载量与HIV-1Gag特异性CD+2IFN-γ+细胞占CD-3细胞的比例呈显著的正相关(r=0.2919,P=0.0339);而01_AE亚型感染者的病毒载量与HIV-1Env特异性CD+2CD107a+细胞占CD-3细胞的比例呈显著负相关(r=-0.3454,P=0.0454)。结论在HIV-1感染早期,感染者体内可以产生Gag蛋白特异性的ADCC反应,其中Env蛋白特异性的ADCC反应具有控制疾病进展的作用。
- 冯晏萌梁华邵一鸣
- 关键词：GAG蛋白病毒载量
- HIV-1gp140蛋白不同聚合体的纯化
- 2016年
- 目的对HIV-1 CN54膜蛋白gp140的不同聚合体进行纯化。方法将在哺乳动物细胞Free Style 293F中表达的gp140蛋白经过糖基化亲和层析、阴离子交换层析和凝胶排阻层析3种纯化方法进行分离,并对该纯化方法进行优化。采用ELISA方法检测不同结构抗原与广谱中和抗体的特异性反应。结果选择lentil lectin填料进行糖基化亲和层析,纯化的gp140蛋白为4.56 mg/L,得率为89.9%;选择弱阴离子填料DEAE用于阴离子交换层析,纯化的gp140蛋白为3.87 mg/L,得率为84.8%;凝胶排阻层析纯化获得了gp140蛋白的多聚体、三聚体+二聚体以及单体3种结构。不同结构的gp140蛋白可与CD4结合位点的广谱中和抗体VRC01以及结构依赖性的V3区特异性广谱中和抗体反应,具有较好的特异性,且不同聚合体在V3区结构依赖性抗体2G12的结合抗体反应上会存在一定差异。结论成功建立了HIV-1 gp140蛋白不同聚合体纯化的方法,该方法对于其他相似蛋白的纯化具有参考作用;不同结构的gp140蛋白的分离为进一步研究其免疫原性奠定了基础。
- 刘建东何彦平鞠斌孙红岩宋伟葛向阳任莉刘颖邵一鸣郝彦玲
- 关键词：HIV纯化
- HIV-1 gp140蛋白疫苗的设计及其免疫原性研究被引量：5
- 2016年
- 目的 设计HIV-1 gp140蛋白疫苗并进行免疫原性初步研究.方法 构建包含不同信号肽的gp140蛋白表达克隆,对表达效率和信号肽切割效率进行比较筛选,同时对不同长度C末端的gp140进行比较,最终获得优化的HIV-1 gp140免疫原.采用不同的免疫方式免疫豚鼠,通过特异性结合抗体检测和中和抗体检测进行免疫效果评价.结果 设计的信号肽具有较好的分泌、切割效率,重组HIV-1 gp140抗原获得良好的表达.重组蛋白疫苗单独免疫就能诱导很强的结合抗体和中和抗体反应,反应强度高于重组DNA疫苗以及痘苗病毒载体疫苗的联合免疫.不同C末端长度的gp140蛋白免疫效果没有显著的差异,但长C末端的gp140蛋白免疫效果稍好.结论 优化设计了HIV-1 gp140蛋白疫苗,设计的重组疫苗获得较好的免疫效果.
- 宋伟刘建东葛向阳任莉邵一鸣郝彦玲
- 重组痘苗病毒HIV疫苗肌注初免蛋白疫苗滴鼻加强后激发高强度黏膜IgA应答反应被引量：1
- 2015年
- 目的研究痘苗病毒载体HIV疫苗和蛋白疫苗联合运用所激发的黏膜免疫应答，探讨不同途径免疫产生黏膜免疫应答的异同，进一步证实MF59佐剂在激发疫苗黏膜免疫应答方面的效果。方法以表达HIV-1中国流行株CN54 Gag—Pol—Env基因的重组痘苗病毒天坛株rTV，重组HIV-1膜蛋白gp140三聚体为抗原，辅以水包油型佐剂（oil—in—water）MF59，在小鼠模型上，通过不同免疫途径组合联合免疫BALB／c小鼠，即重组痘苗病毒初免，免疫途径为滴鼻或肌注，gp140与MF59混合物加强免疫，免疫途径为滴鼻、肌注或皮下，探讨能诱导高效黏膜免疫应答的免疫策略。通过ELISA方法对小鼠血清中HIV-1特异性的IgG和IgA及唾液和阴道分泌物中IgA进行检测。结果MF59是一种良好的黏膜佐剂，能显著增强HIV蛋白疫苗的黏膜免疫应答，所激发的黏膜IgA滴度与鞭毛素蛋白（SF）和霍乱毒素B亚单位（CTB）的黏膜佐剂活性相当；重组痘苗病毒初免（肌注），gp140与MF59加强（滴鼻）联合免疫策略能诱导高水平的血清IgA和黏膜IgA抗体（P〈0．05），其抗体滴度分别高达1：15000和1：600。结论重组痘苗病毒天坛株rTV系统途径免疫小鼠后蛋白疫苗黏膜途径加强能激发高强度黏膜免疫应答，这一免疫策略及组合可为阻断通过口腔和阴道黏膜传播的艾滋病疫苗研究提供参考。
- 刘芳刘莹王荣敏邵一鸣刘颖王书晖
- 关键词：HIV疫苗重组痘苗病毒蛋白疫苗
- 基于流式细胞术评价单核细胞介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应的方法学建立和应用被引量：2
- 2015年
- 目的：建立基于流式细胞术的评价单核细胞介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应的检测方法。方法 PKH26和CFSE染色的P815细胞为靶细胞，与P815特异性抗体孵育形成抗原抗体复合物，加入外周血单个核细胞作为效应细胞，共同孵育后流式细胞术检测 CD3－CD14＋PKH26＋CFSE－细胞群的百分比，并确定最佳效靶比及效应细胞和靶细胞的孵育时间。运用上述方法对23例HCV慢性感染者和22例健康人的单核细胞介导的抗体依赖性细胞毒作用（ antibody depend-ent cellular cytotoxicity ， ADCC）进行比较分析。结果可通过流式细胞技术检测CD3－CD14＋PKH26＋CFSE－细胞群来评价单核细胞介导的ADCC效应，最佳效靶比为10∶1，最佳杀伤孵育时间为4 h。慢性HCV感染者单核细胞介导的ADCC效应较健康对照明显降低（ P＝0．009）。结论本研究建立了基于流式细胞术的单核细胞介导的ADCC效应的检测方法，为病毒感染及药物研发中免疫学评价提供快速、敏感、安全的检测手段。
- 梁华黄向博沈弢邵一鸣
- 关键词：单核细胞流式细胞术
- DNA疫苗-重组痘苗病毒-蛋白疫苗联合诱导HIV-1抗体应答免疫程序的优化
- 2014年
- 比较DNA疫苗、重组痘苗病毒、蛋白疫苗不同免疫组合及免疫间隔时间对免疫效果的影响。采取Primeboost-boost免疫程序对豚鼠进行DNA疫苗初免三次,重组痘苗病毒rTV加强一次,分别间隔4、8、12周后免疫gp140蛋白加强免疫两次;同时,采取Prime-boost免疫程序重组痘苗病毒rTV初免一次,分别间隔4、8、12周后加强免疫gp140蛋白二次。末次免疫后不同时间点采血检测豚鼠血清中HIV-1特异性结合抗体、中和抗体以及抗体的相对亲合力。DNA-rTV-gp140免疫策略诱导的HIV-1gp140/gp120抗体滴度、相对亲合力以及V1V2-gp70抗体OD值均高于rTV-gp140。对DNA-rTV-gp140免疫策略而言,间隔12周的免疫策略较间隔4周诱导了更高的V1V2-gp70抗体,而间隔4周更有利于提高抗体亲合力。rTV-gp140免疫策略间隔8或12周诱导的体液免疫更为理想。DNA疫苗初免,rTV和蛋白疫苗依次加强能够诱导更强的体液免疫,较长的免疫间隔有利于诱导V1V2-gp70抗体,较短的间隔有利于提高抗体亲合力。
- 刘畅王书晖任莉郝彦玲张其程刘颖
- 关键词：DNA疫苗重组痘苗病毒蛋白疫苗免疫程序
- HIV-1早期感染者外周血中CD56＋T细胞表型和功能特征分析被引量：4
- 2015年
- 目的探讨HIV-1早期感染者外周血中CD56＋T细胞表型和功能变化特点，了解该变化与疾病进展状态的相关性。方法采集HIV-1早期感染者样品53例，HIV-1阴性健康对照31例，分离外周血单个核细胞（PBMC）后，流式细胞术检测CD56＋T细胞数量及细胞表面分子CD16、CD161、NKB1、NKG2A、NKp46、NKG2D、NKG2C、CD158a表达水平。将PBMC与K562细胞共孵育，检测CD56＋T细胞分泌细胞因子IFN．吖和TNF—d的水平，以及细胞毒效应分子CD107a的水平。结果HIV-1早期感染者外周血中CD56＋T细胞数量较健康对照明显减少（P=0．025），且与血浆病毒载量呈负相关（P=0．021，r=-0．316）。CD56＋T细胞表面分子CD16（P=0．003）、CD161（P=0．023）、NKBl（P=0．023）、NKp46（P=0．021）表达较健康对照显著降低，其中NKB1的表达水平与CD4＋T细胞数量呈正相关（P=0．007，F=0．364），而与病毒载量呈负相关（P=0．030，r=-0．299）。HIV-1早期感染者CD56＋T细胞自发分泌IFN-1和TNF-d以及细胞毒效应分子CD107a水平明显低于健康对照（P均〈0．001），在靶细胞K562存在情况下，其杀伤能力也显著低于健康对照（IFN-γ和TNF-α：P均〈0．001，CD107a：JP=0．016）。结论HIV-1早期感染者CD56＋T细胞数量下降，表型发生改变，分泌细胞因子和细胞毒效应分子能力下降，提示在HIV-1感染早期CD56’T细胞即受到损伤，且与疾病进展相关。
- 梁华贾曼雪李丹邵一鸣
- 关键词：人类免疫缺陷病毒表型细胞毒效应
- 表达 HIV-1建立感染相关病毒（T／F）膜蛋白的重组痘病毒与蛋白疫苗联合免疫豚鼠后体液免疫特征研究被引量：1
- 2015年
- 目的：研究表达HIV-1建立感染相关病毒（ T／F）膜蛋白的重组痘苗病毒rTT-B、rTT-C和rTT-CON与gp140蛋白疫苗联合免疫豚鼠后抗体反应情况。方法采取Prime-boost免疫策略对豚鼠进行rTT初免1次，间隔4、8周后gp140蛋白疫苗加强免疫2次。免疫前和末次免疫后2、6、10周采豚鼠血，检测血清中HIV-1特异性结合抗体、中和抗体以及抗体的相对亲和力。结果（1） rTT-B、rTT-C和rTT-CON三种病毒和蛋白联合免疫均诱导了强烈的针对HIV-1 B′／C、B、AE亚型特异性结合抗体，抗体滴度范围为111430～1024000，其中，rTT-C和rTT-CON和蛋白联合免疫2周后诱导的B′／C和AE亚型特异性抗体滴度显著高于rTT-B（P＜0．05），但3种病毒蛋白联合免疫诱导的B亚型膜蛋白特异性抗体滴度差异无统计学意义。（2）3种病毒蛋白联合免疫都能诱导较强滴度针对SF162和ZM109的中和抗体，抗体滴度范围为83．76～649．30，3种病毒间差异无统计学意义。（3）3种病毒蛋白联合免疫都能诱导与免疫保护有关的HIV-1 V1V2-gp70特异性抗体，3种病毒间差异无统计学意义。（4）3种病毒蛋白联合免疫诱导的抗体对HIV-1 B′／C、B、AE亚型膜蛋白具有较强亲和力，3种病毒间差异无统计学意义。结论重组痘苗病毒rTT-B、rTT-C和rTT-CON与gp140联合免疫豚鼠后可以有效诱导出针对同源和异源病毒膜蛋白的结合及中和抗体。
- 李猛刘畅任莉郝彦玲刘颖邵一鸣王书晖
- 关键词：重组痘苗病毒蛋白疫苗联合免疫
- IL-15基因佐剂对DNA初始-重组痘苗病毒加强免疫效果的影响被引量：2
- 2012年
- 目的比较IL-15在DNA疫苗初始和重组天坛痘苗病毒加强免疫阶段对免疫原性的影响。方法应用PCR方法构建重组片段I8R-pE/L-IL-15-GFP-G1L,通过同源重组将IL-15基因插入到表达HIV-1CN54Gag,Pol和Env基因的重组天坛艾滋病疫苗rTV的基因组中。HIV DNA疫苗在0、3、6周与质粒pIL-15共免疫BALB/c小鼠,或仅使用DNA疫苗,rTV和rTV-IL-15在12周分别进行加强免疫。末次免疫后1、4周应用ICS和ELISPOT方法检测小鼠脾淋巴细胞中HIV特异性细胞免疫。末次免疫后1、4周和12周ELISA方法检测小鼠血清中Gp120特异性抗体。结果 IL-15基因正确插入重组天坛艾滋病疫苗rTV基因组中,成功构建了重组病毒rTV-IL-15。各组免疫小鼠均诱导出HIV特异性细胞和体液免疫。尽管各组诱导的HIV特异性CD8+T细胞免疫反应差异无统计学意义,但加强免疫后4周,DNA-IL-15/rTV-IL-15组分泌IFN-γ、TNF-α以及IFN-γ/TNF-α双因子的CD8+T效应记忆细胞百分比均值显著高于DNA-IL15/rTV组(P<0.05),分别为0.86%,0.37%和0.31%。DNA/rTV-IL-15组的gp120抗体滴度在加强免疫后1周即达到1∶40 381,显著高于DNA-IL-15/rTV组和DNA-IL-15/rTV-IL-15组(P=0.000 1,P=0.020 5),且抗体滴度持续至12周未见明显下降。而DNA-IL-15/rTV组和DNA-IL-15/rTV-IL-15组的抗体滴度则从加强免疫1周后逐渐上升,在12周达到高峰(1∶11 143,1∶16 889),DNA-IL-15/rTV组4周和12周的抗体滴度显著高于1周(P=0.009,P=0.012)。结论在初始和加强免疫阶段使用IL-15佐剂可以提高CD8+T效应记忆细胞应答水平。
- 田美娟刘莹刘铮彭虹马燕邵一鸣刘颖
- 关键词：白细胞介素15
- 早期 HIV-1感染者单核细胞对 TLR 配体反应性研究被引量：3
- 2014年
- 目的：探讨HIV-1早期感染者体内单核细胞的成熟状态和对TLR配体的反应特点，了解HIV-1感染早期单核细胞功能状态和与疾病进展状态的相关性。方法选取35例HIV-1早期感染者和13例HIV阴性的健康人，采血分离外周血单个核细胞（ PBMC ）后纯化出单核细胞，流式细胞术检测单核细胞表面活化／抑制分子表达。用脂多糖（ LPS）和Pam3CSK4分别刺激单核细胞，培养20 h后，流式细胞术检测单核细胞表面活化／抑制分子表达，ELISA方法检测培养上清中促炎细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6的分泌水平。结果 HIV-1早期感染者，单核细胞表面活化分子CD80、CD86、CD40和抑制分子PD-L1表达均升高（除CD86 P＝0．01外，P均＜0．001），CD40表达水平与血浆病毒载量正相关（P＜0．001，r＝0．553）。单核细胞受LPS和Pam3CSK4刺激后，活化成熟能力降低，HLA-DR、CD80、CD86、PD-L1表达增加均较健康对照低（P＜0．001），而促炎细胞因子 TNF-α（LPS：P＝0．004，Pam3CSK4：P＝0．012）和IL-6分泌（LPS：P＝0．006）增加。结论在HIV-1感染早期，单核细胞即处于免疫活化状态，受TLR配体刺激后促炎细胞因子分泌增加可能与HIV-1感染后的微生物移位和免疫活化相关。
- 梁华赵阳阳李丹邵一鸣
- 关键词：人类免疫缺陷病毒单核细胞
