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小鼠IL-10重组慢病毒载体的构建和病毒包装被引量：1: 2011年; 目的:构建小鼠IL-10重组慢病毒表达载体并进行包装,为进一步研究IL-10基因修饰树突细胞在哮喘免疫耐受中的作用提供实验基础。方法:小鼠IL-10基因片段经PCR扩增后,与酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接,获得PGC-LV-IL-10重组慢病毒并转化细菌感受态细胞。克隆菌落行PCR鉴定,对阳性的重组质粒进行测序并转入293T细胞,荧光显微镜下观察GFP表达并行Western blot鉴定。将重组质粒与慢病毒包装系统一同转染293T细胞进行病毒包装,Real-time定量PCR法检测病毒滴度。结果:DNA测序结果及Western blot鉴定证实成功构建小鼠IL-10重组慢病毒载体,对其进行包装后测定慢病毒滴度为2×108TU/ml。结论:成功构建并包装小鼠IL-10重组慢病毒表达载体。; 陈亮温桂兰许飞; 关键词：IL-10基因慢病毒载体免疫耐受

慢病毒载体介导的IL-10诱导耐受性树突状细胞的形成: 2011年; 探讨通过IL-10重组慢病毒载体转染小鼠未成熟树突状细胞(iDC),构建高分泌IL-10的耐受性树突状细胞的可行性。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)联合诱导并经CD11c免疫磁珠分选获得小鼠骨髓iDC,倒置显微镜下观察,流式细胞术分析细胞表面分子;IL-10重组慢病毒载体转染小鼠iDC,荧光显微镜下观察GFP表达,ELISA法测定转染细胞的IL-10表达水平,并行混合淋巴细胞反应,观察其诱导T淋巴细胞增殖的情况,流式细胞术检测调节性T细胞。结果:获得大量高纯度未成熟DC,随培养时间延长表现出典型的树突状形态,流式细胞术分析显示iDC表面MHCⅡ、CD80、CD86表达水平均显著低于mDC;未成熟DC经IL-10慢病毒转染后,荧光显微镜下观察GFP蛋白高度表达,ELISA检测IL-10表达水平明显高于对照组(P<0.05),且IL-10转染iDC体外刺激T淋巴细胞增殖的能力弱于未转染iDC,但调节性T细胞比例高于后者。IL-10基因通过慢病毒载体介导,成功整合到iDC基因内,使其高表达IL-10,基因修饰后的iDC的致免疫耐受作用得到了增强。; 陈亮温桂兰许飞方乐; 关键词：树突状细胞慢病毒 IL-10 免疫耐受

慢病毒载体介导的TGF-β1基因修饰小鼠未成熟树突状细胞的实验研究: 2011年; 目的探讨慢病毒载体介导的转化生长因子β1(TGF-β1)基因修饰小鼠未成熟树突状细胞(iDCs)的方法。方法体外原代培养小鼠骨髓细胞,经粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)诱导以及抗CD11c抗体包被的免疫磁珠分选获得iDCs,取部分iDCs经肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导为成熟DCs(mDCs),用光学显微镜观察细胞形态,流式细胞术分析细胞的表面分子。将iDCs分为感染组[感染携带绿色荧光蛋白(GFP)与TGF-β1基因的慢病毒颗粒]、感染对照组(感染携带GFP、不携带TGF-β1基因的慢病毒颗粒)及空白对照组(未感染慢病毒颗粒)。采用倒置荧光显微镜及酶联免疫吸附试验(ELISA)对各组iDCs中GFP及TGF-β1的表达进行检测。结果经体外诱导培养及免疫磁珠分选后,获得大量高纯度iDCs,随培养时间延长,iDCs表现出典型的树突状形态;iDCs表面MHCⅡ、CD80及CD86表达水平均明显低于mDCs。感染组iDCs中GFP与TGF-β1蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05)。结论携有TGF-β1基因的慢病毒成功感染小鼠iDCs,并使其表达目的蛋白。; 陈亮许飞温桂兰; 关键词：树突细胞慢病毒感染粒细胞巨噬细胞集落刺激因子

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国家自然科学基金(30860105)