上海市青年科技启明星计划(QMX01423)
- 作品数：38 被引量：68H指数：5
- 相关作者：仲人前邓安梅周晔陈燕陈波更多>>
- 相关机构：第二军医大学斯坦福大学江苏大学更多>>
- 发文基金：上海市青年科技启明星计划国家自然科学基金上海市重大科技攻关项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 荧光定量RT-PCR测定人颗粒溶素基因表达水平被引量：3
- 2007年
- 目的:通过建立荧光定量RT-PCR的方法,检测颗粒溶素(Granulysin,GNLY)mRNA在人外周血单个核细胞(PBMCs)中基因表达的水平。方法:基于TaqMan荧光探针技术,构建克隆载体pMD18-T-GNLY,建立荧光定量RT-PCR方法,并检测了40名正常健康献血者外周血中GNLY的表达水平。结果:内参18SrRNA的动态检测范围为103～108拷贝/μgRNA;而40名正常健康人外周血的PBMCs中均有GNLYmRNA的表达,范围为3.12×106～4.32×107拷贝/μgRNA,均值为[(2.0±1.3)×107]拷贝/μgRNA。结论:建立了人GNLY基因表达水平的荧光定量PCR检测方法,结果准确可靠,为今后进一步研究GNLYmRNA表达水平与感染性疾病免疫机制的相关性研究打下了基础。
- 钱琤陈孙孝周晔陈波蒋廷旺吴传勇邓安梅仲人前
- 关键词：颗粒溶素聚合酶链反应外周血单个核细胞
- 结核分枝杆菌抗原Rv0173的克隆、表达与纯化被引量：1
- 2007年
- 目的在大肠杆菌中表达、纯化结核分枝杆菌Rv0173抗原,为研制新型结核病疫苗打下基础。方法将结核杆菌抗原Rv0173的全长cDNA插入到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建成Rv0173重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组表达蛋白。结果获得了pGEX4T-Rv0173重组子,Rv0173蛋白在BL21菌中获得表达,表达的蛋白条带大小约45KD,与预期结果相符。结论成功地对结核杆菌免疫保护性抗原Rv0173进行了基因克隆与表达,为进一步研究其在结核病新型疫苗研制中的应用奠定了基础。
- 蒋天舒娄加陶周晔陈燕陈波谷明莉仲人前邓安梅
- 关键词：结核分支杆菌表达纯化
- 原发性胆汁性肝硬化动物模型的建立及外周血T淋巴细胞表面CD_(40)配体分析被引量：2
- 2007年
- 目的用聚肌苷酸胞苷酸(polyinosinic polycytidylic acid,PolyI:C)注射 C57BL/6小鼠以研究建立原发性胆汁性肝硬化(PBC)动物模型,探讨 CD_(40)配体(CD_(40)L)在外周血 T 淋巴细胞表面的表达,和在 PBC 中 T 淋巴细胞的活化情况。方法 20只 C57BL/6小鼠随机分对照组和模型组。将polyI:C 以5mg/kg 的剂量腹腔注射模型组小鼠,对照组注射 PBS,每周2次,120 d 后处死,留取外周血和肝组织,间接免疫荧光法检测血清抗线粒体抗体(AMA),HE 染色观察胆管病理变化,生化分析仪测定血清碱性磷酸酶(ALP)含量,流式细胞术分析外周血 CD_4^+、CD_8^+淋巴细胞所占比例及 CD_(40)L在 T 淋巴细胞表面的表达情况。结果 PolyI:C 注射120 d 后模型组小鼠均出现 AMA 阳性,肝组织小胆管周围有不同程度的炎性细胞浸润,血清 ALP 明显高于对照组(P<0.001);对照组胆管及血清ALP 均未发生明显变化;模型组小鼠 CD_(40)L^+/CD_4^+、CD_(40)L^+/CD_8^+T 淋巴细胞[(4.35±0.34)%,(1.42±0.10)%)显著高于对照组[(0.78±0.10)%,(0.43±0.04)%,P<0.01];而模型组小鼠 CD_4^+、CD_8^+T 淋巴细胞所占比例[(25.83±1.80)%,(2.4.84±2.70)%]与对照组[(20.51±3.46)%,(17.84±1.53)%]比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 PolyI:C 腹腔注射 C57BL/6小鼠120d 可引起 PBC 病变,活化的 CD_4^+、CD_8^+T 淋巴细胞在 PBC 发病中起重要作用。
- 蒋廷旺邓安梅吴传勇张玲珍朱烨钱(五争)周晔谷明莉陈波仲人前
- 关键词：肝硬化胆汁性动物T淋巴细胞
- 原发性胆汁性肝硬化患者颗粒溶素的检测及意义
- 2006年
- 原发性胆汁性肝硬化（PBC）是一种慢性胆汁淤积性自身免疫性肝病，主要特征为肝内中小胆管的非化脓性进行性炎性损伤。颗粒溶素（granulysin，GNLY）是由自然杀伤细胞和激活的细胞毒性T淋巴细胞选择性表达的细胞毒分子。我们采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）和酶联免疫吸附法检测PBC患者外周血GNLY的表达，研究GNLY表达在PBC发病机制中的作用，为临床诊治提供依据。
- 钱琤陈波周晔蒋廷旺吴传勇王燕谷明莉邓安梅仲人前
- 关键词：颗粒溶素
- 大肠杆菌发酵生产重组人颗粒溶素被引量：1
- 2007年
- 目的:在FUS-50L生物反应器中利用补料分批培养技术培养表达含重组质粒pET28a(+)-GNLY的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS株,生产重组颗粒溶素(GNLY)。方法:选取含pET28a(+)-GNLY的BL21(DE3)pLysS菌株单个克隆分级培养,将制备的二级种子液接种于发酵罐中。在发酵过程中,控制溶氧为30%～50%,温度为37℃;在基础培养基内生长4h后,补加以甘油为碳源的补料,继续生长到11h;加入葡萄糖至终浓度为1%,30℃诱导表达6h;收集菌体,纯化制备目的蛋白。利用Western印迹检测重组蛋白的抗原性,用CFU方法检测其生物学活性。结果:发酵液中最终菌体密度达80g/L;纯化所得重组蛋白约占菌体总蛋白的5%,含量为60mg/L;经鉴定所获重组颗粒溶素有较好的免疫学活性和生物学活性。结论:用含重组质粒pET28a(+)-GNLY的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达系统,可得到具有生物活性的重组颗粒溶素,为大批量生产提供了条件。
- 钱陈孙孝周晔陈燕谷明莉邓安梅仲人前
- 关键词：颗粒溶素分批补料发酵培养重组蛋白质
- 医院感染中非发酵菌的检出率及其耐药性分析被引量：4
- 2004年
- 目的:了解非发酵菌在我院医院感染中的分布和检出情况以及非发酵菌的耐药性。方法:应用VITEK-AMS鉴定细菌,K-B法作体外药敏试验,统计分析非发酵菌的检出率和药敏情况。结果:非发酵菌的阳性检出率为14.29％,占总感染率的35.24％,其中,铜绿假单胞菌最为常见(构成比为44.22％),其次为鲍曼不动杆菌(32.17％)和嗜麦芽窄食单胞菌(9.23％)。不同感染部位非发酵菌的感染率各不相同,以呼吸系统(痰或咽拭子标本中)的阳性率最高,而中枢神经系统(脑脊液标本中)的阳性率最低。铜绿假单胞菌对多种抗生素表现为较高的耐药率(45.21％),尤其对舒他西林和复方磺胺甲噁唑的耐药率高(92.18％和82.65％);鲍曼不动杆菌对多种抗生素也表现为较高的耐药率(47.85％),尤其对氨曲南、头孢哌酮和庆大霉素耐药率高(78.56％、77.1 9％和70.21％)。嗜麦芽窄食单胞菌的平均耐药率高达64.02％,对亚胺培南全部耐药,对庆大霉素、美罗培南和氨曲南的耐药率也很高(97.61％、92.83％和91.63％)。结论:我院医院感染中非发酵菌的检出率较高。为及时控制非发酵菌感染并防止耐药菌株的产生,治疗非发酵菌感染应根据体外药敏试验结果选用敏感的抗生素或及时调整抗菌药物。
- 赵虎陈险峰周庭银
- 关键词：医院感染非发酵菌药物耐受性
- 自身抗原gp210融合蛋白的重组表达及其临床应用研究被引量：5
- 2007年
- 目的重组表达人核包膜蛋白自身抗原gp210融合蛋白,以用于原发性胆汁性肝硬化(PBC)的临床诊断和病情监测。方法针对基因库中人gp210的cDNA序列设计引物,从正常人的淋巴细胞中提取RNA,通过反转录PCR方法扩增得到相应的基因片段,经测定序列验证后插入表达载体PET28a(+),构建重组表达载体PET28a(+)-gp210,转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达蛋白质,并经SDS-PAGE、Western-blot鉴定重组表达的gp210融合蛋白,进一步经Ni2+亲合层析柱纯化。应用重组gp210融合蛋白建立间接ELISA,检测PBC患者血清中的抗gp210抗体。结果经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了PET28a(+)-gp210重组质粒。经SDS-PAGE、Western-blot鉴定,获得了具有免疫原性的重组gp210融合蛋白。经ELISA检测,PBC患者中抗gp210抗体的阳性率为40.5%,与疾病对照组及正常对照组比较有显著性差异(P<0.05)。PBC患者临床资料分析表明,抗gp210阳性患者中IgM浓度显著高于抗gp210阴性患者;经UDCA治疗后,28位PBC患者中,3例抗gp210抗体由阳性转为阴性,9例抗gp210抗体持续阳性,1例抗gp210抗体由阴性转为阳性,16例抗gp210抗体持续阴性;其他临床症状与抗gp210抗体无显著相关。结论应用重组gp210融合蛋白建立ELISA检测自身抗体,对PBC诊断具有较好的特异性,为PBC的临床诊断和病情监测提供了有力依据。
- 周晔蒋天舒陈燕陈波谷明莉仲人前邓安梅
- 关键词：PBC自身抗原GP210重组融合蛋白
- 基因扩增法快速检测阴沟肠杆菌Amp C β-内酰胺酶
- 2004年
- 目的:建立检测阴沟肠杆菌Amp C β-内酰胺酶(简称Amp C酶),尤其是持续高产Amp C酶的快速方法。方法:合成阴沟肠杆菌amp C和amp D引物,扩增标准及临床分离的阴沟肠杆菌中amp C和amp D的基因片段,判断待检阴沟肠杆菌是否产Amp C酶,尤其是否产持续高产Amp C酶,并用头孢西丁三维试验加以证实。结果:临床分离的214株阴沟肠杆菌中193株amp C基因扩增阳性,其中amp D扩增阴性者为16株;头孢西丁三维试验阳性18株,其中16株amp C基因扩增阳性而amp D扩增阴性,男有2株amp C和amp D均阳性。去阻遏持续高产型标准菌株amp C扩增阳性、amp D扩增阴性,野生型标准菌株amp C和amp D均扩增阴性。结论:用amp C和amp D引物扩增法可检出18株持续高产Amp C酶的阴沟肠杆菌中的16株,阳性率为88.89％。该方法可用于检测阴沟肠杆菌是否产持续高产Amp C酶。
- 赵虎何铭君张时良
- 关键词：AMPΒ-内酰胺酶PCR阴沟肠杆菌
- 定量RT-PCR检测PBC患者外周血中颗粒溶素的基因表达水平被引量：3
- 2006年
- 目的建立检测人颗粒溶素(granulysin,GNLY)mRNA含量的实时荧光定量RT-PCR的方法,并测定PBC患者外周血单个核细胞(PBMC)中GNLY的基因表达水平,探讨GNLY基因表达水平与原发性胆汁性肝硬化(PBC,primarybiliary cirrhosis)发生发展的关系。方法基于TaqMan荧光探针技术,构建质粒pET28a-GNLY,作为定量模板,建立实时荧光定量RT-PCR方法。用此方法测定了60例PBC、60例乙型肝炎肝硬化及60例健康对照者外周血中GNLY mRNA的含量。结果PBC患者GNLY mRNA的表达范围为5.35×107-4.61×109拷贝/μg RNA;健康对照者为9.28×105-7.32×107拷贝/μg RNA。PBC组GNLY mRNA的平均拷贝数显著高于健康对照组(P<0.01)和疾病对照乙型肝炎肝硬化组(P<0.001)。结论成功建立了人GNLY基因表达含量的荧光定量检测方法,PBC患者GNLY mRNA的含量显著高于健康对照组,GNLY表达与PBC的发生发展存在一定的关联性。
- 钱琤陈波陈孙孝周晔王燕谷明莉吴传勇蒋廷旺陈燕邓安梅仲人前
- 关键词：PBC逆转录-聚合酶链反应
- 用重组丙酮酸脱氢酶复合物E2亚单位检测M2抗体及其临床意义被引量：1
- 2007年
- 目的用重组表达的丙酮酸脱氢酶复合物E2亚单位(PDC-E2)检测M2抗体,以利于原发性胆汁性肝硬化(PBC)的早期诊断。方法采用重组表达的PDC-E2建立了免疫印迹法(IBT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。检测40例PBC患者血清的M2抗体,以其他肝病患者、自身免疫病患者、健康体检者作对照。结果40例PBC患者血清中检测出抗PDC-E2抗体阳性37例,阴性3例,阳性率为92.5%,而疾病对照组和健康体检者血清中该抗体检测均为阴性。结论用重组表达的人PDC-E2检测抗体有较好的敏感性和特异性,有助于PBC的临床诊断。
- 陈燕姚定康周晔蒋廷旺吴传勇钱琤邓安梅仲人前
- 关键词：胆汁性肝硬化自身抗体免疫印迹法酶联免疫吸附试验
