国家自然科学基金(30470744)
- 作品数：5 被引量：5H指数：2
- 相关作者：黄宗干曾建明王小中冯文莉赵世巧更多>>
- 相关机构：重庆医科大学附属第一医院重庆医科大学重庆医科大学附属第二医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金重庆市教委科研基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 靶向激活蛋白激酶PKR诱导白血病K562细胞凋亡被引量：2
- 2009年
- 目的:采用双链RNA能激活细胞内蛋白激酶PKR引起细胞凋亡的策略,研究重组慢性粒细胞白血病独特的bcr/ablb3a2型外源反义RNA诱导白血病K562细胞的凋亡及其作用机制。方法:用含bcr/abl融合基因序列40bp的反转录病毒载体RV-40AS作用于白血病K562细胞,以光学显微镜、电子显微镜、FCM法和DNA梯状条带法检测细胞凋亡情况,化学比色法检测caspase-8和caspase-9活性变化,RT-PCR法检测Bax、Bcl-2 mRNA表达变化,并以Western印迹法检测双链RNA依赖性蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR)、磷酸化PKR(p-PKR)、Bax和Bcl-2的蛋白变化。结果:RV-40AS作用K562细胞组在光学显微镜下出现胞体皱缩、染色质浓集以及折光性减弱,电子显微镜下可见细胞质电子密度增大、核固缩和出现凋亡小体;FCM法检测到凋亡细胞占(22.70±1.42)%[未处理组(3.24±0.66)%],DNA电泳出现典型的梯状条带;caspase-8和caspase-9活性升高,PKR蛋白无明显变化,但p-PKR水平升高;Bax的mRNA和蛋白表达均升高,而Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平没有明显变化。对照组和PKR抑制剂处理组均未发生上述改变。结论:bcr/abl反义RNA反转录病毒载体RV-40AS可特异性激活PKR,从而诱导白血病K562细胞发生凋亡,其可能的机制是PKR活化激活了凋亡反应的上游分子caspase-8,并通过上调Bax表达水平、降低Bcl-2/Bax的比值,导致线粒体膜稳定性被破坏,促使凋亡小体形成和caspase-9活化,最终激活其他凋亡分子使细胞发生凋亡。
- 白卫君王小中曾建明赵世巧温健萍肖青曹唯希黄宗干冯文莉
- 关键词：白血病蛋白激酶类细胞凋亡K562细胞
- 自身淬灭荧光定量PCR检测慢性粒细胞白血病bcr/abl mRNA
- 2007年
- 目的利用自身淬灭探针技术建立一种能检测慢性粒细胞白血病（CML）bcr／abl融合基因mRNA的实时荧光定量PCR方法，为CML的诊断、疗效观察以及微量残留白血病（MRD）的监测提供有效手段。方法用逆转录PCR方法（RT—PCR）扩增K562细胞的bcr／abl融合基因，A-T克隆法构建定量标准模板；设计自身淬灭荧光引物（探针），建立自身淬灭荧光定量逆转录PCR方法（FQ—RT—PCR），并对该方法的线性检测范围、灵敏度、重复性、稳定性进行检测；然后检测临床白血病患者骨髓标本bcr／abl mRNA。结果建立的FQ—RT—PCR方法可检测10copies／μl的bcr／abl重组质粒，并能从10^5个正常细胞中检出1个白血病细胞，该方法的批内、批间变异系数（CV）分别为2．1％、6．1％，线性检测范围为10^2-10^9copies／μl。25例CML患者bcr／abl融合基因mRNA表达量中位数为4．50×10^4[（0．45—89．00）×10^4]copies／μg RNA，其中11例慢性期初诊患者bcr／abl mRNA表达量中位数为5．45×10^4[（2．95—19．30）×10^4]copies／μg RNA，6例急变期患者bcr／abl mRNA表达量中位数为13．00×10^4[（4．10～89．00）×10^4]copies／μg RNA，8例慢性期治疗后复查患者bcr／abl mRNA表达量中位数为2．35×10^4[（0．45—5．12）×10^4]copies／μg RNA，CML急变期患者bcr／abl融合基因表达水平与慢性期患者之间差异有统计学意义（q=3．41，P〈0．05）。PCR产物经电泳分析，其中21例CML患者为b3a2型，4例CML患者为b2a2型；3例急性淋巴细胞白血病（ALL）患者中，1例有bcr／abl mRNA表达，为b2a2型。结论所建立的基于自身淬灭探针技术的实时荧光定量PCR检测方法灵敏、特异、重复性好，结果用拷贝数表示，准确可靠，利于标准统一。可广泛用于CML的诊断、疗效观察以及MRD的监测。
- 彭辉冯文莉王小中曾建明肖青潘健曹唯希罗云萍黄宗干
- 关键词：BCR/ABL融合基因
- bcr-abl反义RNA对慢性粒细胞白血病细胞蛋白激酶PKR的影响
- 目的：bcr/abl 融合基因及其编码的融合蛋白在慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leuke- mia,CML)发生发展中起重要的作用。双链 RNA 依赖性蛋白激酶 PKR 是在哺乳动物中表达、
- 冯文莉曾建明王小中赵世巧白卫君黄世峰田文君
- 关键词：白血病蛋白激酶
- 文献传递
- 重组逆转录病毒RV-40AS对K562细胞裸鼠移植瘤的实验研究
- 2008年
- 目的通过重组逆转录病毒RV-40AS表达bcr-abl反义RNA,激活蛋白激酶PKR引起靶细胞表型改变的策略,研究RV-40AS对K562致瘤裸鼠的抗肿瘤效应。方法建立K562细胞裸鼠移植瘤模型,瘤体注射重组逆转录病毒上清,观察裸鼠瘤体生长状况,于实验终点处死小鼠检测瘤体大小,用western blot检测瘤组织PKR、真核细胞蛋白合成启动因子eIF2α及其磷酸化(p-PKR、p-eIF2α)蛋白质水平。3H-亮氨酸掺入实验检测细胞总蛋白质合成水平。结果RV-40AS作用组裸鼠的瘤体明显小于对照组,瘤重抑制率为61.9%(P<0.05);p-PKR和p-eIF2α蛋白质表达水平有不同程度上调(88%和53%)。3H-亮氨酸掺入实验显示RV-40AS组细胞总蛋白质合成受抑。结论逆转录病毒RV-40AS能激活PKR从而抑制白血病K562细胞移植瘤裸鼠模型的瘤体生长,激活PKR可作为白血病治疗的又一策略。
- 曾建明冯文莉赵世巧白卫君王小中温健萍曹唯希罗云萍涂植光黄宗干
- 关键词：动物实验逆转录病毒载体K562细胞
- 重组逆转录病毒双表达载体的构建及其对K562细胞增殖活性的影响被引量：1
- 2006年
- 目的构建针对慢性粒细胞白血病bcr-abl b3a2型mRNA的双表达逆转录病毒载体,初步探讨其对K562细胞表型的影响。方法以逆转录病毒载体pMSCV-neo为骨架,构建eGFP及针对bcr-abl b3a2型mRNA的反义RNA双表达载体pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL40AS,同时构建对照载体pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL40S和pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL80AS,酶切及测序鉴定各重组载体;以脂质体法转染各载体到PT67包装细胞后,G418筛选稳定的病毒产生细胞株,再以NIH3T3细胞测定病毒滴度并感染K562细胞,计数细胞数绘制细胞生长曲线,FCM检测细胞凋亡情况、并用Westernblot检测PKR激活情况。结果酶切及测序结果证实各重组载体构建完全正确;G418筛选到高滴度重组逆转录病毒生产细胞株:PT67-MSCV/GFP、PT67-40as、PT67-40s和PT67-80as,且PT67-40as上清感染组K562细胞生长受抑制,其24h时早期细胞凋亡率为22.54±3.19%,与除PT67-80as组外的其余各组相比有显著差异(P<0.05);PT67-40as和PT67-80as处理组细胞PKR磷酸化水平分别增高了59.20%和60.33%,2AP能抑制PT67-40as的作用。结论成功构建重组逆转录病毒双表达载体,并发现其能抑制K562细胞生长并引起细胞凋亡,通过激活PKR抗肿瘤可望成为肿瘤新的靶向治疗策略。
- 曾建明冯文莉王小中赵世巧白卫君罗云萍温健萍涂植光黄宗干
- 关键词：PKR反义RNA逆转录病毒载体
- 靶向激活蛋白激酶PKR对白血病K562细胞增殖的影响及机制被引量：2
- 2007年
- 背景与目的:由t(9;22)(q34;q11)导致的bcr-abl融合基因在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)发病中起着重要的作用。本研究运用CML特异的bcr/abl融合基因的mRNA与外源重组反义RNA形成双链RNA(double strand RNA,dsRNA)能激活双链RNA依赖性蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR)的策略,研究其对白血病K562细胞增殖的影响及可能的机制。方法:将dsRNA类似物聚肌苷酸-聚胞啶酸(Polyriboinosinic Polyribocytidylic Acid,polyIC)、含bcr/abl融合基因序列40bp的逆转录病毒载体RV-40AS、RV-40AS+2-氨基嘌呤(2-aminopurine,2AP)和含绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的逆转录病毒载体RV-GFP作用于K562细胞,并以ECV304细胞作对照细胞株。通过细胞计数、MTT法和半固体集落形成实验检测其对细胞生长增殖的影响,用流式细胞仪检测处理前后细胞周期的变化,用Western blot法检测细胞内PKR、磷酸化PKR(phosphated PKR,p-PKR)、真核翻译启始因子2α(eukaryotic initiation factor-2α,eIF2α)、磷酸化eIF2α(phosphated eIF2α,peIF2α)蛋白表达的变化,用3H-亮氨酸掺入实验检测细胞总蛋白合成水平的变化。结果:polyIC对K562细胞和ECV304细胞生长和增殖均具有非特异性抑制作用,而RV-40AS仅对K562细胞具有特异性的抑制效应。PKR抑制剂能阻断RV-40AS对K562细胞的抑制效应。polyIC和RV-40AS作用K562细胞24h后,S期细胞减少[polyIC组(37.26±2.35)%,未处理组(58.53±5.42)%,P<0.05;RV-40AS组(31.48±3.65)%,未处理组(58.53±5.42)%,P<0.05],G0/G1期细胞增多[polyIC组(50.97±2.18)%,未处理组(36.44±4.20)%,P<0.05;RV-40AS组(57.47±3.61)%,未处理组(36.44±4.20)%,P<0.05]。polyIC处理K562细胞组、ECV304细胞组以及RV-40AS处理K562细胞组的p-PKR和p-eIF2α蛋白表达显著上调,且总蛋白合成水平下降[RV-40AS处理的K562细胞组(3.5±1.9)cpm/ng,未处理组(26.8±2.6)cpm/ng,P<0.05]。结论:外源重组反义RNA与bcr/abl融合基因的mRNA形成�
- 赵世巧冯文莉曾建明白卫君王小中温健萍曹唯希罗云萍黄宗干
- 关键词：白血病蛋白激酶K562细胞细胞增殖
