国家自然科学基金(30470762)
- 作品数：5 被引量：19H指数：3
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- 人端粒酶催化亚单位启动子调控自杀基因HSV-TK靶向性表达治疗肺癌的体内外实验研究被引量：5
- 2008年
- 目的研究人类单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)/更昔洛韦(GCV)治疗系统在人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子的调控下对肺癌细胞A549的体外靶向性增殖抑制作用和对裸鼠体内A549移植瘤的治疗效果。方法1用已构建的hTERT启动子和SV40启动子调控的TK基因表达质粒pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞A549及端粒酶阴性的人胚肺细胞MRC-5,RT-PCR方法检测转染细胞中TK基因的表达情况;2MTT法检测GCV对上述转染细胞体外增殖的抑制作用;并应用流式细胞仪检测GCV对上述转染细胞凋亡的影响;3将A549细胞接种于裸鼠皮下,研究pGL3-hTp-TK/GCV和pGL3-SV40-TK/GCV对移植瘤的体内生长抑制作用。结果1转染pGL3-SV40-TK的A549和MRC-5细胞均有TK mRNA表达,转染pGL3-hTp-TK的A549细胞也有TK mRNA表达,但MRC-5细胞无TK mRNA表达;2GCV对转染pGL3-SV40-TK的A549、MRC-5细胞和转染pGL3-hTp-TK的A549细胞的体外增殖均有明显抑制作用,对转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞无明显抑制作用;转染pGL3-SV40-TK和pGL3-hTp-TK的A549细胞经GCV处理后细胞凋亡指数(分别为21.58%和23.19%)均显著高于转染pGL3-hTp的A549细胞及空白对照,转染pGL3-SV40-TK的MRC-5细胞凋亡指数(9.35%)显著高于对照组,而转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞凋亡指数(0.88%)无明显升高;3pGL3-SV40-TK/GCV和pGL3-hTp-TK/GCV治疗系统对裸鼠A549移植瘤的生长具有明显抑制作用,抑瘤率分别为46.7%和40.5%,均显著高于各阴性对照组(分别为9.7%,14.3%,7.0%和8.0%)。结论hTERT启动子可以调控HSV-TK基因在肺癌细胞中靶向性表达,HSV-TK/GCV治疗系统在hTERT启动子调控下对肺癌细胞A549的体外增殖和裸鼠体内的移植瘤生长均有明显的抑制作用。
- 王艳萍唐小军周清华车国卫陈小禾朱大兴
- 关键词：自杀基因端粒酶催化亚单位靶向性表达
- 异种移植抗原α-gal介导人血清杀伤A549细胞的实验研究
- 2012年
- 背景与目的人体α-1,3半乳糖基转移酶(α-1,3Galactosy ltransferase,α-1,3GT)基因功能失活而不表达α-半乳糖基(α-galactosyl,α-gal)表位,但天然存在着大量抗α-gal抗体,异种器官移植研究结果提示,在人肿瘤细胞上重新表达异种移植抗原α-gal,可能诱发类似于宿主抗移植物超急性排斥反应的抗肿瘤效应。本研究通过基因导入手段,建立稳定表达异种移植抗原α-gal的转基因人肺癌细胞系,探讨α-gal介导的人血清抗肿瘤的可能性及其机制。方法将前期成功构建的α-1,3GT基因真核表达质粒pEGFP-N1-GT瞬时转染人肺腺癌细胞A549,筛选并建立稳定的转基因细胞系A549-GT。MTT增殖实验和显微镜观察转基因细胞生物学特性变化;RT-PCR检测A549-GT中α-1,3GT基因mRNA表达;荧光素标记的凝集素(FITC-BS-IB4lectin)染色检测α-1,3GT在肿瘤细胞表面合成α-gal的能力;A549-GT细胞及其培养基分别与正常人细胞共培养,检验α-1,3GT基因的稳定性和酶活性的稳定性;人血清结合实验检测A549-GT与IgM和补体C3结合情况。结果RT-PCR检测到转基因细胞系A549-GT中有α-1,3GTmRNA表达。荧光显微镜和流式细胞术检测结果显示:A549-GT能够长期稳定表达异种移植抗原α-gal表位;A549-GT与其亲本细胞在生长形态及增殖速度上无明显差异;A549-GT细胞及其培养基分别与正常人胚肺成纤维细胞MRC-5共培养均不能使MRC-5获得α-gal合成能力;经人血清处理后,荧光免疫实验观察到转基因细胞系A549-GT能与血清抗体IgM结合并诱导补体C3结合。结论异种移植抗原α-gal在肿瘤细胞上的重新表达,可能通过补体依赖的细胞毒机制,介导类似于异种器官移植排斥反应的抗肿瘤效应。
- 朱圣明谢玲郑鸿秦凤刘美骆志国王艳萍
- 关键词：异种抗原A549细胞
- 中国近交系版纳微型猪α1，3-半乳糖基转移酶基因的克隆及其真核表达载体的构建被引量：3
- 2009年
- 克隆中国近交系版纳微型猪(Banna minipig inbred-line,BMI)α1,3-半乳糖基转移酶基因(α1,3-galacto-syltransferaseα1,3-GT)并构建其真核表达载体。从版纳微型猪肝脏中提取总RNA,RT-PCR扩增出α1,3-GT cD-NA全长序列,克隆到pMD18-T载体,测序后再克隆到质粒pEGFP-N1中,构建α1,3-GT真核表达载体pEGFP-N1-GT。用脂质体法瞬时转染人肺腺癌细胞A549,RT-PCR检测转染细胞中α1,3-GT mRNA的表达;利用荧光素标记的植物凝集素(FITC-BS-IB4lectin),直接免疫荧光法检测转染细胞中α1,3-GT合成α-Gal表位的能力。结果显示版纳微型猪α1,3-GTcDNA全长1116bp,其序列与GenBank中小鼠和牛α1,3-GTcDNA具有高度同源性,与猪α1,3-GTcDNA全长序列完全一致。酶切和PCR证实重组真核表达载体pEGFP-N1-GT构建成功。转染pEG-FP-N1-GT的A549细胞有α1,3-GTmRNA表达,在其细胞膜检测到α-Gal表位的表达。中国近交系版纳微型猪α1,3-GTcDNA的克隆及其真核表达载体的构建为该基因在异种器官移植和肿瘤免疫治疗中的进一步研究和应用奠定了基础。
- 朱圣明王艳萍郑鸿程惊秋陆燕蓉曾养志王宇王竹
- 关键词：Α1,3-半乳糖基转移酶异种移植
- 端粒酶催化亚单位基因启动子调控Hsv—tk/GCV系统对肺癌细胞A549选择性杀伤作用的研究被引量：11
- 2007年
- 目的研究人端粒酶催化亚单位（human telomerase catalytic subunit，hTERT）基因启动子调控单纯疱疹胸苷激酶／更昔洛韦（herpes simplex virus-thymidine kinase／ganciclovir，Hsv-tk／GCV）治疗系统对人肺癌细胞株A549的选择体外杀伤作用。方法（1）用脂质体法将hTERT启动子和sv40启动子调控的比基因表达质粒（pGL3-hTp-tk和pGL3-sv40-tk）转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞株A549及端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞株MRC-5，用逆转录-PCR方法检测转染细胞中此基因的表达情况；（2）用MTT法检测GCV对上述转染细胞体外增殖的抑制作用；（3）用流式细胞仪检测GCV对上述转染细胞凋亡和细胞周期的影响。结果（1）转染pGCS-sv40-tk的细胞A549、MRG5和转染pGCS-hTp-tk的A549均有tk mRNA表达，转染pGL3-hTp-tk的MRC-5无tk mRNA表达；（2）GCV对转染pGL3-sv40-tk的细胞A549、MRC-5和转染pGCS—hTp-tk的A549体外增殖均有明显抑制作用，对转染pGL3-hTp-tk的MRG-5无明显抑制作用；（3）转染pGL3-sv40-tk的A549、MRC-5和转染pGL3-hTp-tk的A549细胞，GCV处理后细胞凋亡指数（21．58％、9．35％和23．19％）均显著高于转染pGL3-hTp的A549和MRC-5细胞（0．78％和0．55％）及空白对照A549和MRC-5细胞（2．17％和0．60％），转染pGL3-hTp-tk的MRC-5细胞凋亡指数（0．88％）无明显升高。结论hTERT启动子调控Hsv-tk基因可以在肺癌细胞中选择性表达，hTERT调控的Hsv-tk／GCV治疗系统对肺癌细胞体外增殖具有靶向性抑制作用。
- 唐小军王艳萍周清华车国卫陈小禾朱大兴
- 关键词：肺癌自杀基因端粒酶催化亚单位
- 稳定表达猪α1,3-半乳糖苷基转移酶基因的人肺腺癌细胞系的建立和鉴定被引量：2
- 2010年
- 目的建立稳定表达中国近交系版纳微型猪(BMI)α1,3-半乳糖苷基转移酶基因(α1,3-GT)和α-半乳糖基(Gala1-3Galb1-4GlcNAc-R,α-gal)的人肺癌细胞株,为进一步研究人体血清经补体依赖的细胞毒性作用杀伤表达异种移植抗原的肿瘤细胞提供细胞模型。方法将含有版纳微型猪α1,3-GT基因的pEGFP-CMV-GT质粒经脂质体法体外转染人肺腺癌细胞A549,G418筛选稳定表达的细胞克隆并扩增,命名为A549-GT。用RT-PCR检测A549-GT中α1,3-GT基因的mRNA表达,荧光显微镜和流式细胞仪检测α1,3-GT在细胞膜表面合成α-gal表位的能力以及A549-GT与人血清中Ig M和补体C3结合情况。检测转染细胞形态学、生长增殖能力以及裸鼠成瘤性等生物学特征。结果经G418反复筛选获得了稳定转染α1,3-GT基因的A549-GT的细胞系,该细胞中检测到α1,3-GTmRNA和α-gal表达。A549-GT传代至今已2年,α-gal表达的阳性细胞达80.1%±3.2%。A549-GT细胞能与人血清中的Ig M结合并有补体C3沉积。其生物学特性与亲代A549细胞相比未发生变化。结论成功获得持续稳定表达猪α1,3-GT和α-gal的细胞系A549-GT,为该基因在后续肿瘤免疫治疗中的研究提供有用的细胞研究模型。
- 秦凤朱圣明郑鸿王竹王宇左莹陈娟孙蔚亮王艳萍
- 关键词：A549细胞基因转染
