浙江省自然科学基金(302781)
- 作品数：9 被引量：7H指数：1
- 相关作者：俞康胡永仙沈志坚谭映霞梁彬更多>>
- 相关机构：温州医学院附属第一医院温州医学院华盛顿大学更多>>
- 发文基金：浙江省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- Anti-CD20-scFv-IgGFc基因修饰T细胞诱导Raji细胞凋亡的研究
- 2007年
- 背景与目的:研究重组anti-CD20-scFv-IgGFc的pLNCX质粒转染T淋巴细胞后,用锚定的T细胞杀伤Raji细胞,观察其诱导Raji细胞凋亡的能力。材料与方法:重组质粒通过脂质体转染至逆转录病毒包装的PA317细胞中,600μg/ml的G418筛选3周后,用PA317细胞培养液感染的外周血T细胞和T细胞分别去杀伤等量的Raji细胞,于不同时间点用流式细胞仪检测Raji细胞Annexin Ⅴ和Bcl-2的阳性率。结果:流式细胞仪检测发现在24h内,CD20阳性的Raji细胞上Annexin Ⅴ阳性率明显高于对照组,Bcl-2的阳性表达率较对照组明显降低。结论:含anti-CD20-scFv-IgGFc重组子基因修饰的T细胞在数小时内就可引起Raji细胞发生凋亡,其早期凋亡可能通过启动Annexin Ⅴ,同时通过抑制Bcl-2的表达而加快Raji细胞凋亡达到靶向杀伤的作用。
- 潘智勇谭映霞俞康吴建波章圣辉韩义香
- 关键词：CD20
- 榄香烯对B细胞淋巴瘤Raji细胞株的体内外抑制作用被引量：3
- 2011年
- 目的:探讨榄香烯对B细胞淋巴瘤Raji细胞株的体内外作用。方法:不同浓度的榄香烯体外作用Raji细胞不同时间,CCK-8法检测增殖抑制作用,Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡,DAPI染色进行细胞核形态学分析,PI单染色法检测细胞周期改变;动物实验观察榄香烯体内抑瘤作用。结果:榄香烯对Raji细胞生长具有明显的抑制作用,呈量效和时效关系;榄香烯能诱导Raji细胞凋亡,呈量效关系;DAPI染色显示榄香烯作用Raji细胞具有凋亡细胞核的特征性核形态;细胞周期分析显示G0/G1期细胞相对增多、S期和G2/M期细胞均相对减少;榄香烯明显抑制Raji细胞在SCID小鼠体内增殖。结论:榄香烯对Raji细胞具有明显的增殖抑制作用,其机制可能是通过G0/G1期阻滞导致细胞凋亡发挥效用的。
- 徐希庄彦章圣辉俞康
- 关键词：榄香烯RAJI细胞动物实验
- 真核表达载体pLNCX/anti-CD20scFv/IgGFc/CD80/CD28/ζ的构建及其在NIH 3T3细胞株中的表达被引量：1
- 2007年
- 目的:构建pLNCX/anti-CD20scFv/IgGFc/CD80/CD28/ζ的重组真核表达载体,并在NIH 3T3细胞株中表达。方法:采用DNA重组技术把pBULLET上的CD28-ζcDNA插入到已含anti-CD20scFv/IgGFc/CD80的真核表达载体pLNCX质粒上,转染NIH3T3细胞株,经G418筛选细胞,用RT-PCR、流式细胞术检测目的基因表达情况。结果:经菌落PCR、酶切及一次测序鉴定均证实pLNCX/anti-CD20scFv/IgGFc/CD80/CD28/ζ的成功构建;经RT-PCR法,能够从转染的NIH 3T3细胞中扩增出1条与目的基因大小一致的DNA片段,流式细胞术检测显示该目的基因能够在NIH 3T3细胞中表达目的蛋白。结论:重组表达载体pLNCX/anti-CD20scFv/IgGFc/CD80/CD28/ζ的构建,并在NIH3T3细胞株中的成功表达。
- 胡永仙俞康谭映霞吴建波沈志坚钱红兰梁彬单大铭
- 关键词：NIH3T3细胞
- 抗CD20scFv／CD80／CD28／ζ重组基因修饰T细胞的构建与靶向杀伤效果被引量：1
- 2007年
- 目的构建表达抗CD20scFv／CD80／CD28／ζ重组基因修饰T细胞，体外观察其特异性清除CD20^＋淋巴瘤细胞的能力，为肿瘤的过继免疫治疗提供新思路。方法采用DNA重组技术将pBULLET上的CD28-ζcDNA插入到已含有抗CD20scFv／CD80的真核表达载体pLNCX质粒上，转染PA317包装细胞，挑取高滴度的包装细胞收获病毒，用收获的病毒感染刺激分裂的人外周血T淋巴细胞，经G418筛选1周后与CD20^＋淋巴瘤细胞株Daudi、Raji在体外共同培养，用非放射性的细胞杀伤试剂盒和ELISA检测试剂盒分别检测T细胞的抗原特异性杀伤和细胞因子分泌的功能。结果酶切及测序鉴定均证实pLNCX／抗CD20seFv／CD80／CD28／ζ构建成功，重组基因修饰的T细胞能在体外杀伤CD20^＋淋巴瘤细胞株Daudi、Raji，而对CD20^＋细胞株K562无杀伤作用，同时CD20^＋靶细胞组上清液中IL-2和IFN-γ水平与CD20^-组相比明显升高。结论重组基因修饰的CD20靶向性T细胞构建成功。该T细胞在体外能特异性杀伤CD20^＋淋巴瘤细胞株。
- 胡永仙俞康谭映霞沈志坚江松福钱红兰梁彬单大铭
- 关键词：T细胞受体肿瘤免疫治疗
- 重组anti－CD20 scFv／CD80／CD28/ζ非复制型逆转录病毒的构建及其在Jurkat细胞株中的表达
- 2008年
- 目的:构建表达anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ重组非复制型逆转录病毒,转染Jurkat细胞株使其表达目的蛋白。方法:采用DNA重组技术把pBULLET上的CD28-ζcDNA插入到已含anti-CD20 scFv/CD80的真核逆转录病毒载体pLNCX质粒上,转染PA317细胞株,收获上清液获非复制型逆转录病毒,感染NI H3T3细胞株,用PCR、流式细胞术检测目的基因在NI H3T3细胞的表达情况,确定病毒滴度。挑取高滴度的包装细胞株收获病毒,感染Jurkat细胞,经G418筛选细胞,用RT-PCR检测目的基因表达情况。结果:经酶切及测序鉴定均证实pLNCX/anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ的成功构建;用PCR能够从逆转录病毒感染的NI H3T3细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段;流式细胞术检测显示该目的基因能够在NI H3T3细胞中表达目的蛋白;经RT-PCR,能够从转染的Jurkat细胞株中扩增出1条与目的基因大小一致的DNA片段。结论:成功构建高滴度表达anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ非复制型逆转录病毒,并能在Jurkat细胞中表达目的蛋白。
- 胡永仙俞康谭映霞沈志坚钱红兰梁彬单大铭
- 关键词：逆转录病毒3T3细胞JURKAT细胞
- 抗CD20scFv—Fc—CD28／ξ基因修饰T细胞靶向杀伤Raji细胞的研究
- 2009年
- 目的研究重组抗CD20scFv—Fc—CD28／ξ基因修饰T淋巴细胞在杀伤Raji细胞时T细胞活化情况和诱导Raji细胞凋亡的变化，进一步探讨特异基因修饰T细胞杀伤淋巴瘤细胞的机制。方法将重组质粒转染至PA317细胞中，用转染成功的PA317培养液感染外周血T淋巴细胞后，用800μg／ml的G418筛选1周后杀伤Raji细胞，分别在不同时间点用流式细胞仪检测Raji细胞Bcl-2的阳性率，用ELISA检测培养上清液中的IL-10、IFN-γ。结果Raji细胞Bcl-2的阳性率在24h内就明显下降，72h内由98．43％下降到38．45％，下降幅度明显高于对照组和空白组。72h检测IL-10发现实验组为100．3pg／ml，明显低于对照组（210．88pg／ml）和空白组（286．71pg／m1），同时IFN-γ的分泌量（1487．23pg／ml）也显著高于对照组。结论抗CD20介导的T细胞靶向杀伤Raji细胞不需要CD28的协同刺激。CD28和CD3ξ同刺激可增强T细胞抑制Raji细胞IL-10表达使其降低Bcl-2的表达从而加速靶细胞的裂解。CD28／ξ在没有外源协同刺激分子B7／CD28时能充分激活T细胞，促进其分泌IFN-γ，增强了抗CD20修饰T细胞靶向杀伤Raji细胞的能力。
- 谭映霞俞康胡永仙章圣辉韩义香高中孟吴建波
- Anti-CD20scFv/IgGFc/CD80/CD28/zeta转染人T淋巴细胞对原代CLL细胞的作用被引量：1
- 2010年
- 目的:将已成功构建表达anti-CD20scFv/CD80/CD28/zeta转染人T淋巴细胞,体外观察该类细胞特异性清除CD20+原代慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞的能力,为肿瘤的过继免疫治疗提供新思路。方法:将本室成功构建的含anti-CD20scFv/IgGFc/CD80片段的PLNCX质粒,转染PA317包装细胞,挑取高滴度的包装细胞株收获逆转录病毒,用收获的病毒感染刺激分裂的人外周血T细胞,经G418筛选后与CD20+原代CLL细胞在体外共同培养,在显微镜下观察CD20+的原代CLL细胞生长状态,ELISA检测试剂盒检测T细胞分泌细胞因子的功能。结果:重组基因修饰的T细胞能在体外杀伤CD20+原代CLL细胞,而对CD20-细胞无杀伤作用;同时靶细胞为CD20+组上清液中IL-2(1301.00pg/ml)和IFN-γ(602.18pg/ml)水平与CD20-组相比明显升高。结论:嵌合锚定T细胞能够成功构建;该类T细胞在体外能特异性杀伤CD20+的原代CLL细胞。
- 钱红兰俞康沈志坚梁彬罗盛邢冲云胡永仙
- 关键词：CD20
- 重组anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ非复制型逆转录病毒的构建
- 2007年
- 目的:构建pLNCX/anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ的重组真核表达载体,转染PA317细胞株,包装制备重组非复制型逆转录病毒。方法:采用DNA重组技术把pBULLET上的CD28-ζcDNA插入到已含anti-CD20 scFv/CD80的真核逆转录病毒载体pLNCX质粒上,转染PA317细胞株,经G418筛选,收获上清液获非复制型逆转录病毒,将病毒感染NIH3T3细胞株,用PCR、流式细胞术检测目的基因在NIH3T3细胞中的表达情况,确定病毒滴度。结果:经酶切及测序鉴定均证实pLNCX/anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ的成功构建;采用PCR方法能够从逆转录病毒感染的NIH3T3细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段;流式细胞术检测显示该目的基因能够在NIH3T3细胞中表达目的蛋白。结论:成功构建高滴度表达anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ非复制型逆转录病毒,并能在NIH 3T3细胞中表达目的蛋白。
- 胡永仙俞康谭映霞沈志坚梁彬钱红兰单大名
- 关键词：逆转录病毒NIH3T3细胞
- 抗CD20阳性淋巴瘤单抗真核表达载体的包装及增殖被引量：1
- 2008年
- 在我国,恶性淋巴瘤在儿童和青年中所占比例较高。大部分恶性B细胞淋巴瘤呈CD20高表达状态,利妥昔单抗是针对CD20抗原的单克隆抗体药物,能准确地识别并与之结合，并通过人体免疫清除这些肿瘤细胞，然而该药物单独治疗B细胞淋马瘤的效率仅达到48%。本实验用包装细胞对抗CD20阳性淋马瘤单抗真核表达载体PLNCX/anti-CD20-scFv-Fc-￡进行包装，并通过测定病毒滴度的方法来检测其增殖情况，报告如下。
- 蒋龙翔俞康吴建波沈志坚谭映霞胡永仙
- 关键词：逆转录病毒载体包装细胞病毒滴度
