山西省科技攻关计划项目(20080311059-6)
- 作品数：5 被引量：17H指数：2
- 相关作者：常冰梅李美宁张悦红张栋牛勃更多>>
- 相关机构：山西医科大学首都儿科研究所中国医学科学院北京协和医学院更多>>
- 发文基金：山西省科技攻关计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- NK4蛋白在大肠埃希菌中的表达、纯化、复性及活性测定被引量：1
- 2011年
- 目的在大肠埃希菌(E.coli)中高表达NK4蛋白,经鉴定、纯化、复性后测定其生物学活性。方法采用重组DNA技术对已有质粒pGEX-4T-1-NK4和pBV220-HGFα进行改造,构建质粒pBV220-NK4,并使其转化E.coliBL21(DE3),温控诱导表达目的蛋白NK4。蛋白鉴定采用SDS-PAGE和Western blot;蛋白纯化采用包涵体超声破碎、洗涤和Sephacryl-S200凝胶过滤层析。经梯度稀释复性后,采用MTT法和免疫细胞化学方法检测重组蛋白NK4对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)ECV304增殖的作用。结果重组质粒pBV220-NK4酶切图谱和序列测定与预期一致。SDS-PAGE显示有相对分子质量49 000的目的蛋白,表达量为30%。Western blot结果证实目的蛋白带有NK4的氨基端,经包涵体洗涤、层析后NK4的纯度为95%。复性后的NK4可抑制ECV304增殖,并抑制ECV304增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclearantigen,PCNA)的表达。结论我们建立了NK4的原核高表达体系及纯化制备工艺,所制备的NK4蛋白具有生物学活性,为大规模制备有活性的NK4及深入研究其相关功能奠定了基础。
- 常冰梅刘晓军李美宁张悦红程牛亮牛勃
- 关键词：NK4原核表达纯化活性测定
- 人肝细胞生长因子在毕赤酵母中的分泌表达及其活性
- 2011年
- 目的在毕赤酵母中分泌表达人肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF),并检测其活性。方法从真核表达质粒pRC/CMV-HGF中扩增HGF的编码基因,将其克隆入表达载体pPIC9K,构建重组表达质粒pPIC9K-HGF,电穿孔法转化毕赤酵母菌株KM71,PCR筛选阳性菌株,经甲醇诱导表达重组人HGF(rhHGF)。表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,检测其对原代培养的大鼠肝细胞增殖的影响。结果重组表达质粒pPIC9K-HGF经酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约80 000,表达量占菌体总蛋白的18%,可与兔抗人HGF多抗特异性结合,并可刺激大鼠肝细胞增殖。结论在毕赤酵母菌中成功分泌表达了rhHGF,表达产物具有促进肝细胞增殖的活性。
- 常冰梅刘晓军李美宁张栋张悦红程牛亮牛勃
- 关键词：肝细胞生长因子毕赤酵母肝细胞细胞增殖
- 肝细胞生长因子基因转染对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移的影响被引量：2
- 2011年
- 目的:观察HGF基因对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移的影响。方法:从已有质粒pRc/CMV-HGF中扩增出HGF基因,将其克隆到含增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体中,构建重组质粒pEGFP-HGF,酶切及测序鉴定正确后,用脂质体将重组质粒pEGFP-HGF转染到人脐静脉细胞株ECV304中,G418筛选获得稳定表达细胞克隆,采用荧光显微镜观察、RT-PCR、免疫细胞化学方法检测鉴定重组质粒的表达情况;酶联免疫吸附法(ELISA)检测稳定表达细胞中HGF的含量;再以MTT法检测转染重组质粒后细胞增殖的改变,Transwell Migration实验检测细胞迁移能力的改变。结果:所构建重组质粒经酶切图谱分析和序列测定证实构建成功;荧光显微镜下观察到有绿色荧光;RT-PCR证实HGFmRNA在转染阳性细胞高表达;免疫细胞化学证实转染pEGFP-HGF质粒的细胞有HGF蛋白的表达;ELISA检测细胞培养基中HGF含量可达112.3 ng/ml,MTT法、TranswellMigration测定转染pEGFP-HGF阳性细胞的增殖、迁移能力明显高于对照组(P<0.01)。结论:重组质粒pEGFP-HGF能够在内皮细胞株ECV304转录、表达;表达的活性蛋白HGF刺激ECV304的增殖、迁移,为进一步应用于基因治疗奠定实验基础。
- 常冰梅李美宁刘志贞张悦红程牛亮牛勃
- 关键词：HGF基因内皮细胞增殖迁移
