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基于空腔填充效应构建伯克霍尔德菌脂肪酶LipA的热稳定性突变体: 2019年; [目的]中温伯克霍尔德菌胞外脂肪酶LipA在工业领域具有重要的应用价值。利用蛋白质工程技术来提高其热稳定性,对开发脂肪酶LipA酶制剂及提高其应用范围及应用效果,具有重要的意义。[方法]利用生物信息学软件Castp、Voronoia和Cave分析LipA分子中存在的空腔及其组成氨基酸残基;利用FoldX软件构建上述氨基酸残基的突变体电子文库,并基于空腔效应(体积变小)、自由能变化值(降低)和空间结构特点等对前述突变体电子文库进行筛选。从突变体电子文库中选择具有代表性的突变体,通过基因工程技术,引入突变。经诱导表达后,实验验证并筛选出热稳定性的突变体。[结果]构建了一个由58个突变体组成的电子文库;并对其中17个代表性的突变体进行了实验验证;筛选到2个热稳定性有明显提高的突变体LipA-His^15Pro和LipA-Ala^210Val;其叠加突变体LipA-His^15Pro/Ala^210Val的T50^12较野生型LipA提高了8℃,在55℃下的半衰期较野生型脂肪酶LipA提高了23.1倍。[结论]基于空腔填充技术构建热稳定性伯克霍尔德菌胞外脂肪酶LipA突变体,是一种行之有效的策略。; 刘艳如李鑫董盼盼黄建忠舒正玉; 关键词：半衰期

Burkholderia sp.ZYB002中lipA基因的敲除对细胞脂肪酶活性的影响: 2014年; Burkholderia sp.ZYB002菌株不仅能产生大量的胞外脂肪酶,还能产生大量的细胞结合脂肪酶。对细胞结合脂肪酶的种类进行定性研究,将为开发全细胞脂肪酶催化剂奠定基础。通过分析与Burkholderia sp.ZYB002菌株具有较高同源性的Burkholderia cepacia J2315菌株的脂肪酶基因家族,推测潜在的细胞结合脂肪酶编码基因。通过同源重组插入失活Burkholderia sp.ZYB002菌株的lipA基因,筛选出突变体转化子;测定突变体菌株细胞结合脂肪酶的活性,并与野生型菌株比较。试验结果表明,lipA基因插入失活的Burkholderia sp.ZYB002-ΔlipA菌株的细胞结合脂肪酶活性降低了42%。; 时韶磊林红舒正玉刘艳如李欣武海龙黄建忠; 关键词：基因敲除

伯克霍尔德氏菌ZYB002脂肪酶lipC24基因的克隆、表达及其酶学性质被引量：2: 2015年; 【目的】克隆伯克霍尔德菌ZYB002菌株中的新型脂肪酶lip C24基因,测定其基本酶学性质,为后续深入研究该基因在菌株中的生理功能奠定基础。【方法】根据洋葱伯克霍尔德菌JK321菌株的全基因组DNA信息,直接设计引物从伯克霍尔德菌ZYB002菌株基因组中扩增出lip C24基因,并对之进行原核表达、重组蛋白的纯化及酶学性质分析。【结果】lip C24基因全长1317 bp,编码438个氨基酸残基;多肽链中具有保守五肽-G-X1-S-X2-G-序列;重组蛋白Lip C24的分子量为45 k Da;能有效水解各种对硝基苯酯,对中链脂肪酸的对硝基苯酯表现出偏爱性;其催化水解反应的最适温度为40℃,最适p H7.5;40℃下的半衰期为15.72 min,在p H 7.0-8.0的条件下,具有较好的稳定性。【结论】lip C24的编码产物为一个45 k Da蛋白,具有明显的脂肪酶活性,为中温中性脂肪酶。; 林红黄建忠舒正玉刘艳如武海龙李欣江贤章叶菲郑贞芬林跃鑫; 关键词：酶学性质

植物根际芽胞杆菌菌种资源采集及其具有过水解催化活性水解酶基因的克隆被引量：1: 2020年; [背景]芽胞杆菌源枯草杆菌蛋白酶(subtilisin carlsberg)、乙酰基木聚糖酯酶(acetyl xylan esterase)和头孢菌素乙酰水解酶(cephalosporin acetyl hydrolase)具有较高的过水解催化活性,有商业开发价值。[目的]挖掘芽胞杆菌菌株中具有过水解酶催化活性的水解酶蛋白基因,为后续制备过水解酶及酶法合成过氧乙酸奠定基础。[方法]利用定向筛选培养基,从植物根际及纳豆产品中筛选产蛋白酶芽胞杆菌候选菌株,并利用RFLP及16S rRNA基因对其进行鉴定。从蛋白酶高产芽胞杆菌菌株中克隆枯草杆菌蛋白酶、乙酰木聚糖醋酶和头孢菌素乙酰水解酶的全长基因。[结果]从植物根际土壤及纳豆产品中共分离到85个候选菌株,RFLP及16S rRNA基因鉴定结果表明候选菌株均为芽胞杆菌,分别属于Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Bacillus pumilus和Bacillus megaterium四个类群。从B.subtilis NSYT-3克隆的枯草杆菌蛋白酶基因编码的多肽链全长381个氨基酸,从B.pumilus OSLJ-3克隆得到的乙酰基木聚糖酯酶基因编码的多肽链全长320个氨基酸,从B.subtilis NSYT-3克隆的头孢菌素乙酰水解酶基因编码的多肽链全长318个氨基酸,3D结构模拟表明这3个酶蛋白均具有α/β水解酶折叠家族蛋白结构特点。[结论]芽胞杆菌源具过水解催化活性水解酶基因的克隆,为后续开发酶法合成过氧乙酸工艺奠定了基础。; 王倩李欢郑琳贾文敬黄建忠李欣董思圳舒正玉; 关键词：根际细菌芽胞杆菌

介孔二氧化硅载体在酶蛋白固定化中的应用被引量：3: 2021年; 介孔二氧化硅材料因制备简单、生物相容性良好、比表面积和孔径可控、表面修饰基团多样等特点,被广泛应用于酶蛋白的固定化。主要综述了介孔二氧化硅对水解酶、氧化还原酶等酶蛋白的固定化效果及其影响固定化效果的因素,展望了介孔二氧化硅在酶蛋白固定化中的应用前景及存在的挑战,为介孔二氧化硅更好地应用于固定化酶制剂的制备奠定基础。; 董思圳秦风贾文敬李欢董宛阡李林黄建忠舒正玉; 关键词：介孔二氧化硅酶蛋白固定化生物催化剂

细菌脂肪酶在大肠杆菌细胞表面的功能性展示被引量：1: 2014年; 细胞表面展示技术已广泛应用于突变文库的高通量筛选,有力地促进了蛋白质工程的发展。以来自于铜绿假单胞菌的自转运蛋白Est A的羧基端结构域作为锚定区,构建脂肪酶LipA与EstA羧基端结构域的融合基因,并将融合基因插入到改造后的pACYC-Duet表达载体中,获得表面展示载体pBCCB-X1。将载体pBCCB-X1分别导入到大肠杆菌JK321和大肠杆菌UT5600菌株中,以IPTG诱导融合基因的表达。分别用三丁酸甘油酯定性检测和pNPO定量检测诱导表达后的全细胞脂肪酶的水解活性。试验结果表明,脂肪酶LipA在大肠杆菌JK321和大肠杆菌UT5600细胞表面均得到功能性展示,水解活性分别为(2.8±0.1)U/OD和(2.6±0.06)U/OD。脂肪酶LipA在大肠杆菌细胞表面的功能性展示,为后续高通量筛选LipA突变基因文库,奠定了坚实的基础。; 徐丽香王作镇舒正玉武海龙刘艳如李欣黄建忠; 关键词：大肠杆菌细胞表面展示枯草芽胞杆菌

酶法原位制备过氧乙酸对活性艳蓝KN-R氧化脱色的工艺被引量：4: 2015年; 利用过水解酶催化合成过氧乙酸,过氧乙酸原位氧化活性艳蓝KN-R脱色.在单因子试验的基础上,通过正交优化试验确定活性艳蓝KN-R的最佳脱色条件为:在5 m L反应体系中,最适p H 5.0,加酶量为20 U·反应-1,乙酸乙酯对过氧化氢的摩尔比率为40∶1和活性艳蓝KNR的浓度为80 mg·L-1.在此条件下反应6 h后,活性艳蓝KN-R的脱色率为81.11%,24 h后的脱色率为91.96%.在50倍放大试验中,该工艺24小时的脱色率为84.55%.; 武海龙舒正玉林红李婷刘艳如叶菲慕向朵李欣江贤章黄建忠; 关键词：过氧乙酸原位制备脱色活性艳蓝KN-R

热稳定性伯克霍尔德菌脂肪酶A突变体的筛选被引量：3: 2015年; 【目的】为更好地提高伯克霍尔德菌ZYB002脂肪酶LipA在TMP纸浆造纸工艺中的应用,有必要利用蛋白质工程技术,提高其热稳定性。【方法】基于B-factor值筛选LipA多肽链中潜在的突变位点,利用迭代饱和诱变技术,构建突变文库,筛选热稳定性提高的突变体。【结果】利用上述方法,从4个突变文库中分别筛选到在55℃下,半衰期较野生型脂肪酶LipA分别提高了1.8倍、3倍、2.2倍和1.7倍的脂肪酶突变体。【结论】基于B-factor值选择突变位点,利用迭代饱和突变技术,快速筛选到热稳定性有显著提高的突变体。; 刘艳如邱黎清黄建忠赵丙春王作镇朱晓兰高媛媛舒正玉; 关键词：热稳定性 B值

伯克霍尔德菌ZYB002胞外脂肪酶的分离纯化及其酶学性质分析被引量：3: 2014年; 伯克霍尔德菌ZYB002胞外脂肪酶发酵上清液经冻干、透析、DEAESepharose Fast Flow层析柱和SephadexG-75层析柱等步骤纯化后，获得电泳纯的脂肪酶．纯化后的脂肪酶分子质量为33ku，水解棕榈酸对硝基苯的比活力为1902．5U·mg^-1．脂肪酶催化水解反应的最适温度和最适pH值分别为50℃和8．5；在30-65℃和pH3．0-10．0的范围内保持相对稳定．脂肪酶对烷烃、非离子型表面活性剂等有机溶剂具有较好的耐受性．在最适条件下，脂肪酶水解pNPP的k和‰。。分别为3．79mmol·L^-1和714．29μmol·mg^-1·min^-1．; 刘艳如邱芳锦舒正玉王作镇邱黎清李欣江贤章黄建忠; 关键词：分离纯化酶学性质

自转运蛋白作为细菌表面展示系统的研究进展被引量：3: 2015年; 细菌表面展示技术已成功应用于生物技术、生物医药等诸多领域。在众多细菌表面展示系统中,基于自转运蛋白构建的细菌表面展示系统因其强大的外源蛋白展示能力,展现出良好的应用潜力和应用前景。本文综述了当前已发现的自转运蛋白的种类、已解析的自转运蛋白的结构及其分泌过程,概述了基于自转运蛋白构建的细菌表面展示系统的优点及其应用情况。; 刘艳如王作镇赵丙春黄建忠朱晓兰邱黎清舒正玉

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