江苏省自然科学基金(BK2007077)
- 作品数：9 被引量：19H指数：3
- 相关作者：李碧春田智泉任丽伟丁爱军孙敏更多>>
- 相关机构：扬州大学中国农业科学院家禽研究所苏州大学更多>>
- 发文基金：江苏省自然科学基金国家自然科学基金国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 体外重组神经氨酸酶的表达及其亚细胞定位研究
- 2011年
- 研究神经氨酸酶(NA)基因在体外培养NIH-3T3细胞中的表达定位。实验构建了真核表达载体pcDNA3.0/EGFP-NA与pcDNA3.0-NA,采用聚乙烯亚胺介导基因转染法,分别转染NIH-3T3细胞,转染48 h后在荧光倒置显微镜下观察,并分别用RT-PCR与间接免疫荧光(IFA)进一步检测。结果表明:成功构建了EGFP-NA融合蛋白的表达载体;RT-PCR检测到EGFP-NA融合蛋白的表达;NIH-3T3细胞EGFP标记观察显示绿色荧光分布在胞质近胞膜,细胞核内无绿色荧光;间接免疫荧光鉴定显示,绿色荧光分布在细胞膜内外,表达的重组NA蛋白定位在细胞膜上。
- 任丽伟丁爱军傅德智李碧春
- 关键词：绿色荧光蛋白重组质粒
- 提高基因转染效率方法的研究被引量：6
- 2010年
- 本研究旨在提高基因转染的效率。试验使用聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)介导质粒pEGFP-N1转染NIH-3T3细胞,分为两组,分别进行一次转染和二次转染,于转染48h后在荧光倒置显微镜下观察。结果显示,部分细胞发出绿色荧光,二次转染组发绿色荧光的细胞明显多于一次转染组,且二次转染法可以明显提高基因的转染效率。
- 任丽伟丁爱军徐贵江李碧春
- 关键词：基因细胞转染效率
- 鸡Mx基因2032位点单核苷酸多态性研究被引量：5
- 2009年
- 研究采用错配PCIK-IKFLP的方法对15个品种鸡的Mx基因进行筛查，旨在探索不同鸡品种Mx cDNA第2032位点抗病基因A与易感等位基因G的多态性，为生产转基因鸡的可行性提供理论基础。结果表明：15个鸡品种Mx基因的2032位点存在A、G2个等位基因，AA、AG、GG3种基因型，其中鹿苑鸡、狼山鸡、斗鸡未发现AA型个体，茶花鸡、红色原鸡未发现GG个体；携带帆抗性基因A和易感基因G的比例分别是0．350、0．650：抗性等住基因A的检测比例为0．034～0．984。红色原鸡的抗性等位基因A基因频率（0．984）高于地方鸡种的抗性等住基因A的基因频率（0．321）；地方鸡种中的观赏型、蛋肉兼用型、肉用型、蛋用型鸡种的抗性等位基因A的基因频率分别为0．221、0．297、0．425、0．462。χ^2适合性检验表明，15个品种的鸡群均处于Hardy—Weinberg平衡状态。
- 吴晓伟范敏其倪黎纲程旭梅陈强田智泉李碧春
- 关键词：MX基因抗性基因单核苷酸多态性
- 鸡抗病毒Mx蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达
- 2010年
- 为了利用酵母表达技术制备鸡抗病毒Mx蛋白,试验采用基因工程技术,将编码鸡抗病毒Mx蛋白基因亚克隆至含有分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-Mx;用电转化法将线性化的pPIC9K-Mx转化至毕赤酵母菌株GS115中,G418梯度筛选转化菌;再经MM与MD平板对比生长试验筛选,PCR鉴定目的片段,筛选出高拷贝重组子,该高拷贝菌株分别经0.5%、1%甲醇诱导,表达产物再经SDS-PAGE检测。结果表明:成功构建了鸡抗病毒Mx蛋白基因的毕赤酵母表达载体,经G418抗性筛选得到高拷贝菌株;在甲醇含量维持在1%时,鸡抗病毒Mx蛋白在毕赤酵母GS115中获得良好表达,表达产物大小约为75ku;表达蛋白约占表达上清液的39.2%。
- 田智泉杨海燕徐琪孙敏许峰任丽伟丁爱军秦玉蓉李碧春
- 关键词：毕赤酵母MX蛋白
- 鸡Mx-EGFP融合表达蛋白的细胞亚定位及其抗病毒活性研究被引量：1
- 2010年
- 为探索鸡Mx基因在细胞中表达的位置,以及Mx-EGFP融合表达时的抗病活性。构建了真核表达载体pcDNA3.0/EGFP-Mx,转染NIH-3T3细胞,通过报告基因EGFP的表达来定位Mx基因在细胞中表达的位置;通过抗VSV病毒试验来研究Mx-EGFP融合蛋白的抗病毒活性。结果显示,融合蛋白大部分在细胞质中表达,而细胞核中也有一部分表达;转染有质粒pcDNA3.0/EGFP-Mx的NIH-3T3细胞感染VSV病毒48h内,细胞没有发生病变;而只转染pcDNA3.0空载体的阴性对照组中,NIH-3T3细胞48h内已经发生病变。研究结果表明,Mx-EGFP融合蛋白主要分布在细胞质中,具有抗VSV病毒活性,能够延缓病毒感染病变时间。
- 田智泉倪黎纲吴晓伟任丽伟杨海燕孙敏丁爱军李碧春
- 关键词：MX基因VSV
- 鸡Mx基因原核表达载体的构建及其表达分析被引量：1
- 2009年
- 旨在大肠杆菌中表达鸡抗病毒Mx蛋白,为进一步研究该基因抗病活性奠定基础。本研究通过设计一对特异性引物,从已构建好的鸡Mx基因真核表达载体pcDNA3.0-MMx上扩增出Mx基因开放式阅读框(2118bp),并将其编码区重组于原核表达载体PGEX-6P-1中,经酶切和序列鉴定分析后,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rossetta-gami(DE3),并比较其表达效率。结果显示,经不同浓度IPTG诱导后,该基因在Rossetta-gami(DE3)中获得表达。SDS-PAGE检测结果显示,蛋白大小与预期结果相符,说明重组质粒pGEX-Mx在大肠杆菌中成功诱导表达出鸡Mx蛋白,为下一步鸡Mx蛋白活性检测及抗体制备奠定基础。
- 田智泉孙敏杨海燕任丽伟徐贵江丁爱军李碧春
- 关键词：MX基因克隆原核表达蛋白
- “睡美人”转座子系统介导EGFP转染鸡SSCs条件优化的研究被引量：3
- 2009年
- 利用"睡美人"转座子系统介导增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)报告基因,比较和优化了电穿孔转染条件和精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)对G418的耐受能力。结果表明,在SB与PT-EGFP的比为1∶10,质粒浓度为15μg/mL,细胞处于对数生长期,且细胞密度为106～107/mL时,精原干细胞在电场强度为270V,脉冲时程为80μs,转染后在4℃静置10min的条件下转染效率最高。浓度为400μg/mL的G418对转染后的SSCs进行快速筛选6d时,出现了EGFP阳性克隆。
- 李碧春陈强高波田智泉余飞何先红宋成义常国斌王克华
- 关键词：转座子电穿孔精原干细胞增强型绿色荧光蛋白
- 禽流感病毒NA基因稀有密码子分析及其原核表达被引量：2
- 2009年
- 通过原核表达获取禽流感病毒(AIV)NA蛋白,为深入研究该蛋白的抗病性奠定基础。本试验以pMD19-T-NA为模板,PCR扩增NA基因完整开放阅读框(ORF),然后克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建表达质粒pET-NA;转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析检测;并利用稀有密码子在线分析软件对NA基因ORF进行分析。SDS-PAGE分析显示融合蛋白获得了表达,大小为65.4ku;稀有密码子统计表明,NA基因ORF中稀有密码子的比例高达13.4%,甚至还有多个稀有密码子串联成簇存在。重组质粒pET-NA构建正确,且在E.coliBL21(DE3)中成功诱导表达出目的蛋白。
- 任丽伟丁爱军杨海燕田智泉孙敏徐贵江李碧春
- 关键词：基因大肠杆菌原核表达稀有密码子
- 鸡胚精原干细胞转染EGFP获得转基因精子的研究被引量：2
- 2009年
- 目的:通过精原干细胞体外转染外源基因获得转基因精子。方法:孵化16d的鸡胚睾丸,酶消化获取精原干细胞(SSCs),纯化后体外培养和传代扩增,碱性磷酸酶(AKP)活性和胚胎阶段特异性抗原(SSEA-1)免疫荧光鉴定。电穿孔介导EGFP转染SSCs,G418筛选8d后将阳性SSCs移植入经白消安处理的实验鸡体内。结果:移植后25d采集实验鸡精液检测,精子密度为3.87(1010/L),表达EGFP的成熟精子比率为4.25%;移植后85d,精子密度为3.27(1011/L),表达EGFP的成熟精子比率为16.25%。睾丸组织冰冻切片显示,曲精细管中转染后的SSCs定居在曲精细管的基底部,有表达EGFP蛋白生精细胞。收集实验鸡精液,提取DNA进行PCR扩增EGFP基因,经凝胶电泳检测,精液DNA的条带清晰,与目的片段大小一致。结论:鸡胚精原干细胞体外转染EGFP可获得转基因精子,为进一步生产转基因模型动物拓宽了途径。
- 陈昊孙敏高元丰余飞孙国波田智泉杨海燕任丽伟李碧春
- 关键词：电转染精子发生
