国家自然科学基金(30570877)
- 作品数：13 被引量：32H指数：3
- 相关作者：周波林雪波段炼孙芳李启富更多>>
- 相关机构：重庆医科大学附属第一医院第三军医大学新桥医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 蛋白激酶Cβ2-活性氧交互环介导高糖致内皮细胞损伤记忆效应被引量：5
- 2010年
- 目的以人脐静脉内皮细胞（HUVECs）作为体外模拟高血糖记忆的研究对象，观察蛋白激酶C（PKC）β2、活性氧（ROS）对其表达血管内皮生长因子（VEGF）、血管细胞黏附分子1（VCAM-1）mRNA的影响，并探讨PKCβ2、ROS在其中可能的交互作用。方法将培养的HUVECs分为以下5组：正常糖（NG，5mmol／LD-葡萄糖×3周）组、高糖（HG，25mmol／LD-葡萄糖×3周）组、记忆（M，25mmol／LD-葡萄糖×2周＋5mmol／LD-葡萄糖×1周）组、记忆PKCp，转染[MB，25mmol／LD-葡萄糖×2周＋5mmol／LD．葡萄糖×1周＋PKCp2重组腺病毒（Ad5-PKC[32）]组、记忆＋Ot-硫辛酸（MA，25mmol／LD-葡萄糖×2周＋5mmol／LD-葡萄糖×1周＋62．5μmol／LOt-硫辛酸）组。以RT—PCR法检测VEGF、VCAM．1mRNA表达水平，用荧光显微镜和荧光酶标仪测定ROS水平，采用激光共聚焦检测PKCβ2蛋白的表达和转位。结果（1）HG组和M组VEGF、VCAM-1mRNA表达增加，分别为NG组的1．76倍、1．35倍和1．69倍、1．43倍（P值均〈0．05）。（2）HG组和M组ROS水平分别较NG组升高了86％、80％（P值均〈0．05）；MA组ROS水平较M组下降了38％，同时MA组VEGF、VCAM-1mRNA表达亦较M组显著下调，分别为M组的67％、78％（P值均〈0．05）。（3）HG组和M组PKCβ2核转位激活，定量分析显示，胞质／胞核荧光强度比值均较NG组下降，分别为NG组的70％、74％（P值均〈0．05）；MB组PKCβ2核转位较M组更为明显，胞质／胞核荧光强度比值为M组的77％，同时MB组VEGF、VCAM-1mRNA表达亦较M组进G 步上调，分别为M组的1．29倍、1．18倍（P值均〈0．05）。（4）MA组PKCβ2核转位较M组减少，胞质／胞核荧光强度比值为M组的1．18倍；而MB组ROS水平较M组上调了25％（P值均〈0．05）。结论HUVECs存在高糖记忆效应，PKCβ2-ROS交互环可能介导了这个效应的发生。
- 林雪波周波孙芳陈芳芳
- 关键词：蛋白激酶C活性氧内皮细胞代谢记忆
- 高糖应激致人PRKCD基因过表达内皮细胞模型构建及鉴定
- 2010年
- 目的:构建高糖应激下人PRKCD基因过表达内皮细胞模型并鉴定。方法:设计含AgeⅠ和NheⅠ酶切位点的PRKCD基因上下游引物,以含PRKCD基因的原始质粒为模版,PCR扩增获得PRKCD全部序列,经AgeⅠ和NheⅠ酶切后与同样酶切后的真核表达载体pDC316-LacZα重组获得穿梭质粒pDC316-PRKCD,经PCR及酶切、基因测序鉴定后,与腺病毒骨架质粒pB-HGlox△E1,3Cre共转染293细胞获得重组腺病毒Ad5-PRKCD,行PCR鉴定并反复纯化扩增后用TCID50法测定病毒滴度。分组培养人脐静脉内皮细胞,转染重组腺病毒后于高糖(25mmol/L)负荷,并设立空载体对照及渗透压对照组,以免疫荧光法检测PKCδ在细胞中的表达。结果:目的基因成功插入穿梭质粒,基因测序结果与GenBank公布序列一致,重组腺病毒Ad5-PRKCD经PCR鉴定及免疫荧光鉴定成功。测得病毒滴度为1.0×1010IU/ml。激光共焦聚观察高糖负荷下,胞内PRKCD翻译产物PKCδ荧光表达强度明显增强,为正常对照组的1.5倍(P<0.05),高糖负荷下内皮细胞感染重组腺病毒后PKCδ荧光强度明显增加,浆/核荧光强度比值较高糖组进一步降低了35%(p<0.05),提示核转位明显。结论:成功构建了人重组腺病毒Ad5-PRKCD并有效转染人脐静脉内皮细胞,高糖负荷使PKCδ表达上调并发生核转位激活,为筛选稳定表达PKCδ的内皮细胞株及其蛋白复合体奠定了基础。
- 孙芳周波林雪波段炼李启富
- 关键词：高葡萄糖核转位人脐静脉内皮细胞
- 蛋白激酶Cβ2通过调控PPARα介导高糖诱导的人内皮细胞损伤被引量：3
- 2010年
- 目的研究蛋白激酶C（PKC）β2、PPARα在高糖诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）表达血管内皮生长因子（VEGF）、血管细胞黏附分子1（VCAM-1）mRNA中的作用及相互关系。方法将培养的HUVECs分为以下8组：正常糖（NG，5mmol／L D-葡萄糖）组、高糖（HG，25mmol／L D-葡萄糖）组、渗透压对照（L，NG＋20mmol／L L-葡萄糖）组、正常糖空载体转染（NN，NG＋Ad5-null）组、高糖PKCβ2转染（HB，HG＋AdS—PKCβ2）组、高糖＋非诺贝特（HF，HG＋40umol／L非诺贝特）组、高糖PKCβ2转染＋非诺贝特（HBF，HB＋40umol／L非诺贝特）组，另以非诺贝特共孵育20min作为HF20组，以上各组细胞均培养6d。以RT-PCR检测VEGF、VCAM-1mRNA的表达水平，用Western印迹法测定PPARα蛋白表达，采用激光共聚焦检测PKCβ2蛋白的表达和转位。结果（1）HG组VEGF、VCAM—1mRNA表达增加，分别为NG组的1．91倍和1．56倍（均P〈0．05）；HB组VEGF、VCAM-1mRNA表达较HG组进一步增加，分别为NG组的2．59倍和2．07倍（均P〈0．05）。HF组VEGF、VCAM-1mRNA表达则明显下调，分别为HG组的68％和74％（均P〈0．05）；与HG组相比，HF20组VEGF、VCAM-1mRNA表达差异无统计学意义。（2）HG组PPARα蛋白表达较NG组减少了20％，HB组PPARα蛋白水平进一步下降，为HG组的78％，与HG组相比，HF组PPARα蛋白水平上调了13％（P〈0．05）。（3）HG诱导PKCβ2核转位激活，定量分析示HG组浆／核荧光强度比值较NG组降低37％（P〈0．05），HB组PKCβ2核转位与HG组相比更加明显。结论高糖通过诱导HUVECsPKCβ2核转位，进而调控PPARα表达，增加VEGF、VCAM-1mRNA的表达。
- 林雪波周波孙芳陈芳芳李启富邓华聪
- 关键词：过氧化物酶体增殖物激活受体Α人脐静脉内皮细胞视网膜
- 人蛋白激酶CβⅡ基因开放读码框的克隆及序列分析被引量：4
- 2008年
- 目的:克隆人蛋白激酶CβⅡ基因(PRKCB1)的开放读码框(Open reading frame,ORF),为其进一步的功能研究提供基础。方法:采用逆转录-巢式PCR法,从人脐静脉内皮细胞株中扩增出含PRKCB1基因ORF全长的片段,所得片段经加"A"处理并插入T载体。经蓝白筛选,用特异引物扩增阳性重组子,得到编码人蛋白激酶CβⅡ(Protein kinase CβⅡ,PKCβⅡ)基因的ORF,并与T载体相连,测序鉴定。结果:通过巢式RT-PCR及T/A克隆获取了PRKCB1基因的ORF,测序结果与GenBank报道序列一致。结论:成功克隆了PRKCB1基因的ORF,在技术路线上可以为某些难克隆的基因提供参考。
- 段炼周波李启富
- 关键词：聚合酶链反应
- 携带增强绿色荧光蛋白基因的人PRKCB1真核表达载体构建、转染及活性鉴定
- 2009年
- 目的构建携带增强绿色荧光蛋白基因的人PRKCB1真核表达载体并转染人脐静脉内皮细胞,鉴定所表达蛋白活性。方法从pMD18-T-PRKCB1质粒中,扩增出人PRKCB1并与带有增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pReceiver-M29酶切后连接、转化,所获重组体酶切鉴定及测序。按优化的转染参数,将pReceiver-M29-PRKCB1转染人脐静脉内皮细胞,观察荧光蛋白表达,随机视野下计数转染效率。测定激光共聚焦显微镜下胞膜与胞质的荧光强度比值,鉴定其活化转位。结果构建的真核表达质粒测序与GenBank公布的序列一致。转染后48 h,荧光蛋白表达最佳,转染率为18.6%±1.6%。从胞膜与胞质的荧光强度比值,观察到蛋白的活化转位。结论成功构建真核表达质粒并转染人脐静脉内皮细胞,观察到绿色荧光蛋白表达及蛋白的转位,为筛选稳定表达人蛋白激酶Cβ2的内皮细胞株,及其蛋白复合体分离提供分子工具。
- 段炼周波李启富
- 关键词：真核表达转染绿色荧光蛋白活性
- 二甲双胍下调ROS-PKCβ_2通路对高糖波动加重的人内皮细胞损伤的干预作用被引量：2
- 2011年
- 目的观察波动性高糖与持续性高糖对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血管内皮生长因子(VEGF)、血管细胞黏附分子1(VCAM-1)mRNA表达的影响,探讨活性氧(ROS)和蛋白激酶Cβ2(PKCβ2)在其中的作用及二甲双胍的干预作用。方法将培养的HUVECs分为7组:①正常糖(NG,5mmol/L D-葡萄糖)组,②正常糖空载体转染组(NN,NG+Ad5-null)组,③持续性高糖(SHG,15mmol/L D-葡萄糖)组,④波动性高糖(I HG,5mmol/L D-葡萄糖与25mmol/L D-葡萄糖每24h更换一次)组,⑤波动性高糖+PKCβ2转染(I HGB,I HG+Ad5-PKCβ2)组,⑥波动性高糖+二甲双胍(I HGM,I HG+20μmol/L二甲双胍)组,⑦波动性高糖+选择性的PKCβ2抑制剂CGP53353(I HGI,I HG+10μmol/L CGP53353)组或波动高糖+α-硫辛酸(ALA)(I HGA,I HG+62.5μmol/L ALA)组。RT-PCR法检测细胞VEGF、VCAM-1 mRNA表达水平,荧光酶标仪测定细胞ROS水平,激光共聚焦显微镜下检测PKCβ2蛋白表达和转位情况。结果与NG组比较,NN组的空载体转染对细胞无明显生物学意义(P>0.05)。SHG组和I HG组VEGF、VCAM-1mRNA表达及ROS水平增加,分别为NG组的2.16倍、2.30倍、1.75倍和2.57倍、3.32倍、3.20倍,且I HG组增加更明显(P<0.05)。SHG组和I HG组PKCβ2核转位激活,定量分析显示胞质/胞核荧光强度比值较NG组分别下降了21%和26%,且I HG组下降更加明显(P<0.05);I HGB组PKCβ2核转位较I HG组更显著,胞质/胞核荧光强度比值为I HG组的75%,同时I HGB组VEGF、VCAM-1 mRNA表达以及ROS水平亦显著增高,分别为I HG组的1.38倍、1.45倍和1.25倍(P<0.05)。I HGM组VEGF、VCAM-1mRNA表达及ROS水平均较I HG组明显降低,为I HG组的44%、53%和39%;I HGM组PKCβ2核转位亦较I HG组减少,胞质/胞核荧光强度比值为I HG组的1.20倍(P<0.05)。结论波动高糖较持续高糖更易损伤HUVECs,该作用与ROS-PKCβ2活化密切相关;二甲双胍可通过抑制PKCβ2激活,减轻波动性高糖诱导的HUVECs损伤。
- 陈芳芳周波林雪波段雅倩孙芳
- 关键词：氧化性应激脐静脉内皮细胞二甲双胍
- 蛋白激酶Cδ在高糖致人脐静脉内皮细胞周期阻滞和凋亡中的作用及机制被引量：2
- 2009年
- 目的探讨蛋白激酶C(PKC)δ在高糖诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)周期阻滞和凋亡中的作用及机制。方法实验按以下分组方式处理细胞:正常葡萄糖对照组(NG,D-葡萄糖5.6mmol/L),Ad5-null转染+正常葡萄糖培养组(NN,D-葡萄糖5.6mmol/L),高糖培养组(HG,D-葡萄糖25mmol/L),Ad5-PKCδ转染+高糖培养组(PHG,D-葡萄糖25mmol/L),Ad5-PKCδ转染+高糖+PKCδ抑制剂Rottlerin处理组(PHR,10μmol/LRottlerin)。激光共聚焦显微镜下观察高糖刺激的PKCδ表达变化,流式细胞技术检测各组细胞周期分布、凋亡率。免疫印迹检测磷酸化叉头蛋白O1(p-FOXO1)(S256)及P27kip1蛋白表达水平。结果与NG组比较,NN组的空载体转染对细胞无明显生物学意义(P>0.05)。与NG组比较,HG组PKCδ在HUVECs内的表达显著增加,细胞质与细胞核荧光比值下降,细胞G0/G1期阻滞增加,凋亡率上升,p-FOXO1(S256)及P27kip1蛋白水平升高(P<0.05)。与HG比较,PHG组过表达PKCδ后,细胞质与细胞核荧光比值明显下降(P<0.05),G0/G1期阻滞增加,凋亡率上升(P<0.05),p-FOXO1(S256)及P27kip1蛋白水平进一步升高(P<0.05)。与PHG组比较,PHR组特异性抑制PKCδ活性后,细胞质与细胞核荧光比值增加(P<0.05),细胞周期阻滞及凋亡改善,p-FOXO1(S256)及P27kip1蛋白水平降低(P<0.05)。结论高糖负荷可使HUVECs中PKCδ表达增加并发生核转位激活,导致p-FOXO1(S256)及P27kip1蛋白水平升高,使细胞阻滞于G0/G1期并发生凋亡。
- 孙芳周波林雪波陈芳芳
- 关键词：脐静脉内皮细胞葡萄糖细胞周期阻滞
- p300介导高糖和甲基乙二醛糖化终产物致人系膜细胞氧化应激及纤维连接蛋白表达被引量：1
- 2013年
- 目的观察转录共激活子p300和蛋白激酶C(PKC)β2在高糖及甲基乙二醛糖化终产物(AGEs)诱导人系膜细胞(HMCs)活性氧(ROS)产生和纤维连接蛋白(FN)蛋白表达中的作用及相互关系。方法将培养的HMCs分为以下几组:①正糖组(NG)、高糖组(HG)、渗透压组(LG)、正糖+血清白蛋白组(BSA)、正糖+糖化终产物组(AGEs);②高糖+空载体组(HN)、高糖+PKCβ2转染组(PO)、高糖+PKCβ2抑制剂CGP53353组(PI)、糖化终产物+空载体组(AN)、糖化终产物+PKCβ2转染组(APO)、糖化终产物+PKCβ2抑制剂CGP53353组(API);③正糖+p300抑制剂组(NG+Gar)、高糖+p300抑制剂组(HG+Gar)、血清白蛋白+p300抑制剂组(BSA+Gar)、糖化终产物+p300抑制剂组(AGEs+Gar),以上各组细胞均培养2 d。荧光显微镜及荧光酶标仪检测细胞内ROS水平;Western blot法检测各组细胞p300、PKCβ2及FN蛋白表达。结果 HG组及AGEs组p300、PKCβ2蛋白表达及ROS水平增加,分别较NG组及BSA组增加了1.04倍、1.26倍、0.78倍和1.45倍、1.07倍、0.71倍(P<0.05)。同HG组及AGEs组相比,HG+Gar组及AGEs+Gar组ROS水平显著降低,分别为HG组及AGEs组的43%和39%(P<0.05)。PO组及APO组分别较HG组和AGEs组p300、PKCβ2蛋白表达进一步上调,分别为HG组及AGEs组的1.19倍、1.73倍和1.23倍、1.69倍(P<0.05);PI组和API组p300、PKCβ2蛋白表达显著下调(P<0.05);HN组和AN组p300、PKCβ2蛋白表达分别较HG组及AGEs组差异无统计学意义;HG+Gar组及AGEs+Gar组p300、FN蛋白表达显著下降,分别为HG组及AGEs组的31%、43%和37%、29%(P<0.05)。结论高糖及MGO-糖化终产物通过诱导HMCs转录共激活子p300激活参与系膜细胞氧化应激水平上调及FN蛋白表达。
- 苏红周波段雅倩杜超
- 关键词：P300糖化终产物氧化应激
- 影响人脐静脉内皮细胞脂质体转染pReceiver-M29-PRKCB1效率因素的探讨被引量：3
- 2009年
- 目的:探讨影响人脐静脉内皮细胞转染效率的因素,为优化外源基因在其中的表达提供实验依据。方法:选用适于转染人脐静脉内皮细胞的脂质体lipofectin,采用不同的转染条件:脂质体和DNA的用量;铺板密度;细胞与DNA-脂质体复合物孵育时间转染内皮细胞。荧光显微镜、流式细胞仪测定不同转染参数下的转染效率。结果:⑴24孔板中,铺板密度大于2×l04个/孔和孵育时间超过4h,反而使转染效率下降。⑵随质粒质量增加转染效率逐渐上升,达峰后质粒质量的增加并不能显著增高转染效率。⑶转染效率达峰前,随着脂质体用量的增加,转染效率增高;达峰后,脂质体用量的增加,转染效率反降低。当DNA(μg)和脂质体(μl)的用量比为1∶6～1∶8时,获得最高的转染效率:18.62%。结论:采用优化后的转染参数在人脐静脉内皮细胞转染中可获得较优的转染效率。
- 段炼周波李启富
- 关键词：脂质体转染人脐静脉内皮细胞
- 高糖负荷下人蛋白激酶Cβ_2基因过表达内皮细胞模型的构建及鉴定被引量：8
- 2009年
- 目的应用AdMax系统构建含人蛋白激酶Cβ2(protein kinaseCβ2,PKCβ2)基因的重组腺病毒载体,转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC),高糖刺激下观察蛋白量的表达,构建进一步功能研究的细胞模型。方法从pMD18-T-PRKCB1质粒中,扩增出人PRKCB1。所得片段定向克隆至穿梭质粒pDC315上,后与骨架质粒pBHGlox△E1,3Cre共转染293细胞,经同源重组构建腺病毒Ad-PRKCB1,TCID50测定重组病毒的滴度,免疫细胞化学和RT-PCR方法进行鉴定。构建成功后转染HUVEC,激光共聚焦显微镜(LSCM)下,观察高糖刺激下荧光蛋白转位及表达量,鉴定细胞模型构建。结果通过酶切鉴定目的片段正确插入穿梭质粒。倒置显微镜下观察到细胞的病变效应。测得病毒滴度为7.9×109IU/ml,免疫细胞化学和RT-PCR验证了目的蛋白表达。LSCM下观察到高糖负荷下荧光蛋白转位及过表达。结论成功构建了含PRKCB1基因的重组腺病毒载体并在高葡萄糖负荷下观察到其活化及蛋白过表达,为下一步信号蛋白组学研究提供分子工具。
- 段炼林雪波周波
- 关键词：高葡萄糖细胞模型
