吉林省科技发展计划基金(2005136)
- 作品数：3 被引量：4H指数：1
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- 逆转录病毒载体介导shRNA对人胚胎肾细胞中p53基因的沉默作用被引量：3
- 2006年
- 目的:检测逆转录病毒载体介导的小发夹环RNA(small hairpin RNA,shRNA)对人胚胎肾细胞(HEK293)中p53基因的干扰作用。方法:将人H1启动子由XholⅠ和EcoRⅠ酶切位点插入CMV启动子上游,人CD4基因替代匀霉素抗性基因,作为检测标志。针对人野生型p53基因设计的shRNA被连接在H1启动子的下游,构建含有shRNA的逆转录病毒载体LTRH1-p53,即RNAi表达载体;利用流式细胞术检测逆转录病毒感染HEK293细胞72 h后细胞内P53蛋白水平的变化。结果:成功构建LTRH1-p53载体,该载体感染HEK293细胞后72 h,与感染空病毒载体LTRH1组相比,P53蛋白表达降至空病毒载体LTRH1组的69%(P<0.01)。结论:LTRH1-p53表达载体成功使p53基因沉默,shRNA表达载体的使用为基因功能研究提供有力工具。
- 刘扬马淑梅刘晓冬金顺子徐瑞明武宁赵银龙龚守良刘树铮
- 关键词：RNA干扰逆转录病毒载体SHRNA
- P53在电离辐射诱导的细胞周期解耦联中的作用
- 2008年
- 目的探讨p53基因在电离辐射（IR）诱导的MCF-7细胞周期解耦联中的作用。方法构建RNAi表达载体，经磷酸钙共沉淀法转染293T细胞形成病毒包装颗粒，感染MCF-7后采用Western blot检测P53蛋白的表达，建立p53基因沉默模型。将p53野生型（＋／＋）和沉默模型（-／-）经电离辐射处理后，采用流式细胞术分别测定细胞周期并分析细胞多倍体的变化。结果与p53^＋/＋组比较，p53^-/-模型组G0/G1期细胞百分数减少，S期、G2期增加（P〈0．01），倍体分析表明二倍体数减少，四倍体、八倍体均增加（P〈0．01）。在p53^＋/＋和p53^-/-细胞中，与假照射组比较，4Gy照射后G0／G1期、S期细胞百分数减少，而G2期增多（P〈0．01）；倍体分析表明，照射后二倍体数减少，四倍体、八倍体均增加（P〈0．01）。与p53^＋/＋IR组比较，p53^-/-＋IR组发生G0／G1期、S期细胞百分数减少，G2＋M期增多（P〈0．01），二倍体数减少，四倍体增多（P〈0．01），八倍体无明显差别。结论电离辐射可以诱导细胞发生G2期阻滞和细胞周期解耦联；P53在电离辐射诱导的MCF-7细胞G2期阻滞中发挥作用，而在细胞周期解耦联中可能不发挥作用。
- 马淑梅吴丽珉刘扬施丹易贺庆张洁琼汪海娇刘晓冬
- 关键词：P53基因RNA干扰电离辐射
- p53基因突变子175 H、248 W和273 H的定点突变及表达载体的构建被引量：1
- 2006年
- 目的:定点诱变合成p53基因突变子进而构建表达载体。方法:以野生型p53基因为模板,采用PCR体外定点突变技术,设计2对引物,将突变位点设计在引物上,通过重叠延伸法2次PCR扩增,扩增片段上含有所需要的突变位点,最后将扩增片段克隆入pcDNA3.1载体中。结果:在预期位点已经发生突变,p53基因第175位密码子由精氨酸(cgc)突变为组氨酸(cac),第248位密码子由精氨酸(cgg)突变为色氨酸(tgg),第273位密码子由精氨酸(cgt)突变为组氨酸(cat)。p53基因突变子表达载体成功构建。结论:PCR技术诱导定点突变准确、高效。基因突变体的成功构建,为进一步研究该突变位点奠定了基础。
- 刘扬赵银龙刘晓冬马淑梅龚守良刘树铮
