浙江省医药卫生科学研究基金(2008B39)
- 作品数：6 被引量：17H指数：3
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- 相关机构：浙江省疾病预防控制中心浙江省农业科学院浙江省动物疫病预防控制中心更多>>
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- 浙江省猪血清中乙脑病毒的分离鉴定及抗体的测定被引量：5
- 2010年
- 目的对浙江嘉兴地区采集的猪血清进行乙型脑炎病毒分离鉴定以及了解该地区猪感染乙型脑炎病毒的状况。方法在浙江省嘉兴地区采集猪血清标本,利用病毒分离方法检测猪血清是否携带乙脑病毒,利用间接免疫荧光法对猪血清进行抗体检测。应用荧光定量RT-PCR方法对新分离病毒进行鉴定;设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增新分离乙脑病毒PrM—E基因,并对新分离病毒进行基因分型和E基因的分析。结果共采集240份猪血清标本,抗体检测阳性率为61.6%。其中6月中旬50%以上的猪乙脑病毒抗体呈阳性。分离出3株病毒。经荧光定量RT-PCR鉴定3株病毒均为乙脑病毒,基因分析表明3株病毒均属于基因I型乙脑病毒。对这2株乙脑病毒的E基因区段进行分析,它们之间核苷酸和氨基酸的同源性均为100%。与疫苗株SA14-14-2相比,核苷酸同源性在87.7%,氨基酸同源在97.0%以上。结论浙江省嘉兴地区猪群中存着乙脑病毒的隐性感染或曾经感染过,提示在该地区自然界中存在着乙脑病毒。
- 谢荣辉朱函坪张晓锋徐芳杨章女姚苹苹朱智勇
- 关键词：乙脑病毒E基因抗体
- 流行性乙型脑炎病毒非结构蛋白1基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达被引量：3
- 2011年
- 目的获得流行性乙型脑炎(乙脑)病毒非结构蛋白1(Non-structural Protein 1,NS1)基因并在昆虫细胞中表达,为研制乙脑病毒基因工程疫苗奠定基础。方法逆转录-聚合酶链反应扩增乙脑病毒NS1基因并测序列,定向克隆入杆状病毒(Baculovirus,BV)转移载体pFastBac HTa,获得重组转移载体pFastBac-NS1。并将pFastBac-NS1转化到DH10Bac感受态细胞中,筛选到重组转座子rBacmid-NS1。在脂质体介导下将rBacmid-NS1转染粉蚊夜蛾(Trichoplusia ni,TN)细胞获得重组BV(rBV-NS1)。rBV-NS1感染TN细胞后,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacryamide Gel Eleetrophoresis,SDS-PAG)、间接免疫荧光试验(Indirect Immunofluorescence Assay,IFA)和蛋白质印迹法(Western blotting,WB)检测NS1重组蛋白。结果成功克隆乙脑病毒NS1基因,SDS-PAGE、IFA和WB检测表明,NS1基因在昆虫细胞得到表达,能与乙脑患者血清发生特异性免疫反应,具有免疫原性。结论乙脑病毒NS1在昆虫细胞中表达,为研究NS1的生物学特性和研制基因工程疫苗奠定了基础。
- 谢荣辉程胤凯朱函坪翁景清徐芳姚苹苹朱智勇
- 关键词：流行性乙型脑炎病毒克隆
- 浙江省蚊媒携带流行性乙型脑炎病毒的分布特点被引量：2
- 2009年
- 目的了解浙江部分地区蚊媒及猪携带流行性乙型脑炎（乙脑）病毒情况以及浙江省存在的乙脑病毒基因型别。方法于2007年5月至10月在浙江省仙居、龙泉和慈溪3个县人房及猪舍采集蚊虫标本和猪血清，共采集10662只蚊虫和204份猪血清，蚊虫标本中以淡色库蚊和中华按蚊为主。利用病毒分离和荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）方法检测蚊虫携带乙脑病毒，应用酶联接免疫吸附剂测定（ELISA）方法对猪血清进行抗体检测。应用荧光定量RT—PCR方法对细胞分离株进行病毒鉴定；利用RT—PCR方法扩增新分离乙脑病毒PrM基因，并对细胞分离到的病毒进行基因分型。结果在蚊虫标本中检出7批乙脑病毒核酸阳性样本，并分离出3株病毒，经鉴定3株病毒均为乙脑病毒，基因分析表明3株病毒均属于基因I型乙脑病毒。猪血清有121份阳性，总阳性率为59．3％。6月份有50％以上的猪血清中乙脑病毒抗体呈阳性。结论浙江省部分地区存在着乙脑的传播媒介，在蚊媒和猪中携带有乙脑病毒；采集的蚊虫标本中分离到3株病毒，经鉴定为基因I型乙脑病毒，是近年来在浙江省首次分离到的基因I型乙脑病毒。
- 谢荣辉张晓锋朱函坪徐芳姚苹苹程胤凯张意坚朱智勇
- 关键词：基因型
- 一步法流行性乙型脑炎病毒TaqMan荧光定量反转录聚合酶链反应方法的建立及应用被引量：4
- 2009年
- 目的建立一种特异、灵敏、快速检测流行性乙型脑炎（乙脑）病毒的荧光定量RT-PCR方法。方法根据GenBank登录的乙脑病毒毒株序列，应用生物软件在乙脑病毒基因的保守区设计与筛选引物和探针，对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化，验证方法的特异性、敏感性和重复性。并通过对蚊虫样本的检测，以评价该方法的实际应用价值。结果优化结果表明荧光定量RT-PCR的最佳反应体系为0．1gmol／L探针浓度，0．2gmol／L引物浓度，5mmol／L Mg^2＋浓度。结果表明该方法对乙脑病毒的检测有高度的特异性、通用性，对1～4型登革热病毒、狂犬病毒、汉坦病毒（SEO型与HTN型）均无交叉反应，检测的灵敏度达0．1TCID50，重复性分析表明同一样品Ct值的重复检测4次，其标准差均在合理范围内，分别为0．033、0．079、0．149和0．411。对110批蚊虫标本进行荧光定量RT-PCR检测和病毒分离检测，结果荧光定量RT-PCR检测出7份阳性，而病毒分离则只检测出3份阳性，表明建立的荧光定量RT-PCR方法更敏感，可直接从蚊虫样本中检测乙脑病毒核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右，且操作简便、敏感性高。结论研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR的方法具有特异、敏感、快速的特点，适用于乙脑病原学的快速检测。
- 谢荣辉徐芳朱函坪程胤凯傅桂明姚苹苹翁景清卢亦愚杨章女朱智勇
- 关键词：流行性乙型脑炎病毒
- 猪源性乙型脑炎病毒分离株全基因序列测定和分析被引量：3
- 2012年
- 目的了解猪源性乙型脑炎病毒(乙脑病毒)的基因特征。方法对猪源性乙脑病毒株(JX61)进行全基因组序列测定和基因进化特性的分析。结果猪源性乙脑病毒JX61株全基因组全长均为10 964个核苷酸,含有一个开放阅读框架,编码3 432个氨基酸。与GenBank中选择的41株乙脑病毒全基因序列比较发现,其核苷酸同源为83.6%～99.3%,氨基酸总体同源性为94.9%～99.6%。通过全基因序列进行系统进化分析均显示该毒株属于基因Ⅰ型乙脑病毒。结论猪源性乙脑病毒JX61株属于基因I型,与国内分离株XJP613关系最为接近。提示猪体内的乙脑病毒基因型别有了新的变化,这也是浙江省在猪体第一次分离基因Ⅰ型乙脑病毒。
- 赵灵燕谢荣辉朱函坪徐芳杨章女姚苹苹周小龙朱智勇
- 关键词：乙脑病毒种系发生
- 浙江省基因Ⅰ型乙脑病毒全基因序列的测定及分析被引量：2
- 2009年
- 目的为了获得浙江省乙脑病毒基因组详尽的资料，研究基因Ⅰ型乙脑病毒的分子特征及变异程度，为乙脑病毒分子流行病学及其基因研究提供科学依据。方法设计特异性引物、RT-PCR分段扩增XJ69和XJP613株全基因，PCR产物纯化后克隆于T载体并进行序列测定。通过生物学软件进行核苷酸序列和氨基酸序列分析和病毒的系统进化分析。结果新分离乙脑病毒XJ69和XJP613株全基因组全长均为10964个核苷酸，含有一个开放阅读框架，编码3432个氨基酸。与GenBank中选择的32株乙脑病毒全基因序列比较发现，其核苷酸同源为83．5％～99．2％，氨基酸总体同源性为97．5％～99．7％。通过PrM／C区段、E区段及全基因序列进行系统进化分析均显示该毒株属于基因I型乙脑病毒。结论新分离的乙脑病毒XJ69和XJP613株属于基因Ⅰ型，与上海三带喙库蚊分离株sH17M-07关系最为接近。
- 谢荣辉朱函坪付士红程胤凯徐芳姚苹苹杨章女周小龙朱智勇
- 关键词：种系发生
