重庆市卫生局医学科研项目(2009-2-208)
- 作品数：2 被引量：4H指数：1
- 相关作者：陈庆伟邓玮莫显刚柯大智李桂琼更多>>
- 相关机构：重庆医科大学附属第二医院更多>>
- 发文基金：重庆市卫生局医学科研项目更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 小鼠胰岛素诱导基因1 siRNA稳定表达细胞株的建立及其对细胞胆固醇代谢的影响被引量：4
- 2011年
- 目的构建并筛选针对小鼠胰岛素诱导基因1(insulin induced gene 1,insig1)siRNA的特异性表达质粒,建立稳定转染细胞株,并观察其对小鼠巨噬细胞RAW264.7胆固醇代谢的影响。方法根据GenBank中登录的insig1基因序列及RNA干扰原则,设计3个阳性克隆及1个阴性克隆序列,定向克隆入pGenesil-1质粒,构建insig1 shRNA真核表达质粒,测序鉴定后,脂质体法转染RAW264.7细胞,筛选干扰效果最佳的质粒,将其转染入RAW264.7细胞,经G418筛选建立稳定转染细胞株,采用RT-PCR及Western blot法检测转染细胞中insig1基因的转录水平及蛋白的表达水平,油红O染色观察转染细胞中胆固醇含量的变化。结果酶切及测序结果证实,insig1基因shRNA表达质粒构建正确,其中si-2为干扰效果最佳的质粒;在稳定转染的RAW264.7细胞中,si-2组insig1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平较阴性质粒组和未转染组明显降低(P<0.05),油红O颗粒含量最多。结论成功建立了insig1 siRNA稳定表达细胞株,体外模型证明了对insig1基因的干扰可促进细胞胆固醇摄取。
- 柯大智陈庆伟李桂琼邓玮莫显刚
- 关键词：SIRNARAW264.7细胞胆固醇代谢
- insig-1基因siRNA干扰质粒的构建及对炎症状态下细胞胆固醇代谢的影响
- 2011年
- 目的构建针对insig-1基因的siRNA表达载体,观察其对炎症状态下RAW264.7小鼠巨噬细胞胆固醇代谢的影响。方法根据insig-1核苷酸序列,设计并构建针对insig-1基因mRNA的3个特异性siRNA表达载体(si-1、si-2、si-3)和1个无同源性的阴性对照载体(si-nc),经酶切和测序鉴定确认siRNA载体构建成功后,转染RAW264.7小鼠巨噬细胞,RT-PCR、免疫组化法检测insig-1基因的表达,筛选出最佳抑制基因后,应用酶学方法和油红O染色观察炎症处理后RAW264.7细胞内胆固醇含量的变化。结果经酶切证实,siRNA表达载体构建成功,RT-PCR、Western blot、免疫组化法显示与未转染组相比,si-1、si-2、si-3组RAW264.7细胞中insig-1的mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P<0.05),其中si-2干扰效果最强。酶学方法和油红O染色结果表明,炎症状态下细胞insig-1沉默后胆固醇的含量和油红O颗粒增多。结论成功构建了insig-1基因siRNA干扰质粒,insig-1缺失对炎症状态下细胞胆固醇摄取有促进作用。
- 柯大智陈庆伟李桂琼邓玮莫显刚
- 关键词：RNA干扰
