国家科技重大专项(2009ZX09103-683)
- 作品数：2 被引量：9H指数：2
- 相关作者：冯一建黄程李红亮范开蒋利敏更多>>
- 相关机构：重庆理工大学重庆富进生物医药有限公司更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 应用双启动子共表达体系提高人胰岛素原在毕赤酵母中的表达量被引量：7
- 2012年
- 目的应用AOX1和GAP双启动子共表达体系提高人胰岛素原在毕赤酵母中的表达量。方法用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pMD18-T-HMPIDesB30质粒,回收含短C肽AAK并去掉B链第30位苏氨酸(T)的人胰岛素原类似物HMPIDesB3(0Human mini-proinsulin des B30)片段,插入pGAPZαA载体中,构建重组质粒pGAPZαA-HMPIDesB30,电转化至经质粒pPIC9K-HMPIDesB30异位整合的胰岛素原分泌菌株FJ-H(1pPIC9K-HMPIDesB30/GS115)中,应用抗生素法筛选高表达菌株,并进行发酵试验。结果重组质粒pGAPZαA-HMPIDesB30经双酶切及测序证实构建正确;经Zeocin筛选获得高表达量菌株FJ-H3。经30 L发酵罐发酵,FJ-H3菌株人胰岛素原的表达水平可达1.6 g/L,分别为FJ-H1菌株的1.6倍,FJ-H2菌株(pGAPZαA-HMP-IDesB30/GS115)的5.3倍;经质谱分析,胰蛋白酶酶切后的目的蛋白相对分子质量与理论值相符。结论利用AOX1和GAP双启动子在毕赤酵母中高效表达了人胰岛素原类似物HMPIDesB30,为实现胰岛素的规模化制备奠定了基础。
- 李红亮陈勇陈海容黄程冯一建梅翔何跃范开
- 关键词：胰岛素原毕赤酵母启动子
- 重组人胰岛素类似物DesB^(30)的结构及生物效价分析被引量：2
- 2013年
- 目的确认重组人胰岛素类似物DesB30的结构,分析其生物效价。方法在毕赤酵母中构建表达含有短C肽AAK并去掉B链第30位氨基酸(T)的人胰岛素原类似物HMPIDesB30,经胰蛋白酶酶切纯化获得DesB30。利用N末端氨基酸序列测定,质量肽谱分析,圆二色谱等方法进行结构确认及质量分析。利用RP-HPLC法,小鼠血糖法,脂肪细胞法分析其生物效价。结果 DesB30的N端氨基酸序列、二硫键配对、圆二色谱值与理论值一致,其生物效价与人胰岛素基本一致。结论毕赤酵母分泌表达的胰岛素类似物DesB30结构正确,胰岛素去掉B链第30位的苏氨酸,不影响其生物活性。
- 蒋利敏陈勇李红亮万颖曹宇何跃范开
- 关键词：毕赤酵母胰岛素类似物生物效价
