山东省自然科学基金(Y2004C26)
- 作品数：4 被引量：8H指数：1
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- 人同源盒基因NKX3.1cDNA真核表达载体的构建及表达被引量：1
- 2006年
- 目的:构建人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体,研究其在前列腺癌细胞PC-3、LNCaP中的表达情况。方法:以人前列腺癌细胞LNCaP细胞中的总RNA为模板,RT-PCR扩增NKX3.1基因全长编码片段,T/A克隆至pCR2.1载体中。经酶切、测序鉴定后,将NKX3.1cDNA重组到真核表达载体pcDNA3.1(+)中。将pcDNA3.1-NKX3.1表达载体瞬时转染前列腺癌细胞PC-3和LNCaP细胞,RT-PCR和Western blot法检测NKX3.1cDNA在转录水平和蛋白水平的表达。结果:人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体pcD-NA3.1-NKX3.1经酶切及测序鉴定正确。pcDNA3.1-NKX3.1转染PC-3和LNCaP细胞后,经RT-PCR和West-ern blot证明在mRNA和蛋白水平均能有效表达NKX3.1。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-NKX3.1,转染前列腺癌细胞PC-3和LNCaP后能有效表达。
- 刘闻闻于春晓崔福爱张鹏举胡晓燕陈蔚文张建业姜安丽
- 关键词：真核表达载体基因表达转染
- p53过表达抑制同源盒基因NKX3.1启动子活性被引量：1
- 2007年
- NKX3.1是前列腺特异表达的同源盒基因,在前列腺癌的发生发展中起重要作用,而在前列腺癌进展中常会发生p53的基因突变.为研究两者之间的关系,构建NKX3.1启动子(1040bp)-荧光素酶报告基因重组质粒(pGL3-1040)及其缺失突变体,瞬时转染前列腺癌细胞LNCaP.通过荧光素酶表达活性分析,检测p53过表达对NKX3.1启动子活性的影响.结果表明:p53在LNCaP细胞中过表达可明显抑制NKX3.1启动子活性;RT-PCR及Western引迹检测p53过表达对NKX3.1表达的影响.结果表明,p53过表达可以明显抑制同源盒基因NKX3.1的表达.通过TRANSFAC软件分析,在NKX3.1基因上游-526至-507区存在一个p53反应元件的5′核心序列.缺失pGL3-1040中的p53反应元件核心序列并不能消除p53对NKX3.1启动子的抑制作用,表明p53不是通过p53反应元件直接抑制NKX3.1启动子活性.进一步通过5′缺失突变分析,发现NKX3.1启动子-140～+8bp区仍受p53负调控.此148bp区域中含有一个Sp1和一个CREB元件,瞬时共转染Sp1表达载体或CREB表达载体的结果表明,p53并不是通过与Sp1或CREB相互作用对NKX3.1启动子发挥抑制作用的.上述结果表明,p53过表达可以抑制同源盒基因NKX3.1启动子活性,下调NKX3.1基因的转录,其调控机制有待进一步研究.
- 于春晓刘闻闻吴伟芳陈蔚文张鹏举张琦姜安丽张建业
- 关键词：启动子P53负调控
- 人同源盒基因NKX3·1对前列腺癌细胞的诱导凋亡作用被引量：7
- 2006年
- 构建人同源盒基因NKX3·1cDNA真核表达载体,研究其在前列腺癌细胞PC-3、LNCaP中的表达及对细胞的促凋亡作用.以人前列腺癌细胞LNCaP细胞中的总RNA为模板,RT-PCR扩增NKX3·1基因全长编码片段,将NKX3·1cDNA重组到真核表达载体pcDNA3·1(+)中;将pcDNA3·1-NKX3·1表达载体瞬时转染前列腺癌细胞PC-3和LNCaP细胞,用RT-PCR和Western印迹检测NKX3·1cDNA在转录水平和蛋白水平的表达;绘制细胞生长曲线,观察NKX3·1对前列腺癌细胞增殖的抑制作用;用DNA/ladder和流式细胞术检测NKX3·1对前列腺癌细胞凋亡的影响,进一步用RT-PCR检测凋亡相关基因caspase3、caspase8、caspase9、Apaf1、survivin和Bcl2表达的变化.人同源盒基因NKX3·1cDNA真核表达载体pcDNA3·1-NKX3·1经酶切及测序鉴定正确.pcDNA3·1-NKX3·1转染PC-3和LNCaP细胞后,经RT-PCR和Western印迹证明能有效表达NKX3·1.生长曲线显示,前列腺癌细胞转染NKX3·1cDNA后细胞增殖受到抑制;前列腺癌细胞转染NKX3·1cDNA48h后,DNA电泳呈现具有凋亡特征的DNAladder;流式细胞术检测出现明显凋亡峰;RT-PCR检测凋亡相关基因.结果显示,caspase3、caspase8、caspase9基因表达明显增加,Bcl2基因表达明显减少.本研究成功构建了真核表达载体pcDNA3·1-NKX3·1,转染PC-3和LNCaP细胞后能有效表达,并对细胞具有诱导凋亡作用.
- 刘闻闻于春晓崔福爱张鹏举陈蔚文胡晓燕姜安丽张建业
- 关键词：真核表达载体前列腺癌细胞细胞凋亡
- 人NKX3.1基因启动子的克隆及在不同肿瘤细胞系中启动子活性的测定(英文)
- 2006年
- 目的:克隆NKX3.1基因启动子并检测其启动子活性,为研究NKX3.1基因转录调控的基本机制奠定基础。方法:采用PCR方法从人基因组中扩增NKX3.1基因上游1.04 kb启动子片段并分别克隆到报道基因载体pGL3-basic和pEGFP-1中,通过转染细胞、荧光素酶活性测定及荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,检测其启动子活性。结果:DNA测序结果证实克隆的1.04 kb启动子片段序列正确;pGL3-1.04 kb启动子转染LNCaP细胞后,双荧光素酶活性测定M1/M2=2.7,为pGL3-control活性的1.5倍,为pGL3-basic活性的50倍。表明克隆的人NKX3.1基因上游1.04 kb片段具有较强的启动子活性。为检测此1.04 kb启动子在不同组织细胞中的活性,分别将pGL3-1.04 kb启动子和pEGFP-1.04 kb启动子转染入不同的肿瘤细胞系,检测荧光素酶和绿色荧光蛋白的表达。结果显示1.04 kb启动子在前列腺癌细胞LNCaP中活性最高。采用TRANSFAC数据库分析,发现在1 040 bp片段内含有多种顺式作用元件,它们的功能性将需要进一步实验证明。结论:克隆的人NKX3.1基因上游1.04 kb片段具有较强的启动子活性,并且在前列腺癌细胞LNCaP中活性最高。
- 姜安丽张鹏举胡晓燕陈蔚文贺美兰孔峰张建业
- 关键词：启动子细胞系
