863计划生物领域病毒基因载体研发基地
- 作品数：11 被引量：18H指数：3
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- 相关机构：南方医科大学南方医院第四军医大学中南大学更多>>
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- 重组AAV2/hFⅨ病毒制备及其基因治疗血友病B的实验研究被引量：4
- 2004年
- 目的 制备携带人凝血因子Ⅸ (hFⅨ )基因的重组AAV2病毒 (rAAV2 /hFⅨ ) ,并对用rAAV2 /hFⅨ肌肉注射治疗血友病B模型小鼠的疗效进行评价。方法 通过“一株载体细胞 /一株辅助病毒”的双因素包装策略制备出rAAV2 /hFⅨ ,体外转导BHK 2 1、C2C12细胞后 ,检测细胞培养上清中hFⅨ的表达量 ;肌肉直接注射血友病B模型小鼠后 ,检测其血浆中hFⅨ的抗原水平和凝血活性等指标。结果 转导 2 4h后在细胞上清中即可检测到hFⅨ ,连续检测 12 0h都有表达 ,BHK 2 1、C2C12细胞 2 4h最高表达量分别达到 (5 1.0± 6 .5 )ng/ 10 5细胞和 (6 8.0± 7.2 )ng/ 10 5细胞。rAAV2 /hFⅨ经肌肉直接注射后 ,高、中、低三个剂量组均能检测到小鼠体内高效表达hFⅨ ,在给药后第 3周达到高峰 ,小鼠血浆中hFⅨ的表达量与对照组比较差异有显著性 (P <0 .0 1) ,之后缓慢下降 ,到第 10周仍可检测到低水平hFⅨ表达 ;取第 3周小鼠血浆样品检测凝血功能 ,高、中、低剂量组FⅨ活性均得到明显改善 ,小鼠的割尾实验出血时间明显缩短 ,5min失血量也相应显著减少 ,其中高剂量组hFⅨ最高表达量达到 (387.0± 12 .5 )ng/ml血浆 ,FⅨ活性达到正常水平的 (30 .0± 5 .5 ) % ;给药后第 10周 ,除在注射点外 ,其它主要脏器均未检测到AAV载体DNA。
- 彭建强董小岩彭忞陈立谭淑萍袁洪陈方平薛京伦吴小兵
- 关键词：血友病B模型小鼠基因治疗C2C12细胞转导
- 携带靶向干扰VEGF基因shRNA重组腺相关病毒载体的构建和制备被引量：3
- 2007年
- 目的:构建并制备携带靶向干扰VEGF165基因shRNA的重组腺相关病毒载体.方法:将PCR法扩增所得EGFP-U6-shRNA(VEGF165)片段插入载体质粒pSNAV2.0-lacz-α的EcoRI和SalI酶切位点,构建重组质粒pSNAV2.0-EGFP-U6-shRNA(VEGF165).以HSV1-RapCap/ΔUL2为辅毒,包装rAAV2-EGFP-U6-shRNA(VEGF165)病毒.对所获病毒载体进行PCR,SDS-PAGE鉴定分析、滴度测定和EGFP的活性检测.结果:PCR,SDS-PAGE鉴定分析结果表明靶向干扰VEGF165基因的shRNA片段成功包装入重组AAV2载体,病毒纯度在98%以上.点杂交法测定重组病毒载体基因组滴度约为3×1014v.g.(vector genomes)/L.EGFP活性检测显示重组AAV2感染细胞阳性率在30%以上.结论:成功制备了rAAV2-EGFP-U6-shRNA(VEGF165)病毒载体,为通过RNA干扰技术特异性抑制VEGF基因的表达来阐明VEGF在缺血性脑损伤后各种生物学事件中的作用奠定了实验基础.
- 王卫东陈长生蒋立新陆兵勋
- 关键词：血管内皮生长因子类腺相关病毒
- 病毒载体介导血管内皮生长因子基因表达对大鼠脑缺血后齿状回神经发生的影响被引量：2
- 2008年
- 目的观察重组腺相关病毒(rAAV)载体介导人源血管内皮生长因子165(hVEGF165)基因转移表达对成年大鼠缺血性脑损伤后,海马齿状回神经前体细胞增殖水平的影响。方法SD大鼠27只,随机分为rAAV2组(18只)和对照组(9只),将携带hVEGF165基因的rAAV颗粒立体定向给药至rAAV2组大鼠右侧海马2周后,全部大鼠采用4血管闭塞方法建立大鼠缺血性脑损伤模型,于缺血后6、24和48天时,各组随机选取1/3的大鼠处死,分别应用RT-PCR和免疫组织化学染色法检测大鼠海马hVEGF165 mRNA的表达水平或齿状回神经前体细胞的增殖水平。结果荧光显微镜下观察,rAAV2组大鼠海马齿状回均可见报告基因增强型绿色荧光蛋白的表达;rAAV2组大鼠缺血后6、24和48天时,均有海马hVEGF165 mRNA表达,3个时间点比较无统计学差异(P>0.05);rAAV2组大鼠缺血后6、24和48天时,齿状回神经前体细胞增殖水平较对照组显著增高(P<0.05)。结论rAAV载体可介导目的基因hVEGF165高效转染海马神经元,并促进缺血诱导的齿状回神经前体细胞增殖。
- 谭洁王卫东蒋立新徐江平陆兵勋
- 关键词：脑缺血腺病毒科血管内皮生长因子类基因表达齿状回
- 重组腺相关病毒2型/人肿瘤坏死因子受体:Fc(rAAV2/hTNFR:Fc)的构建和生物学活性研究被引量：1
- 2005年
- 为研究腺相关病毒2型载体应用于类风湿性关节炎进行基因治疗的可行性,首先构建携带人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和人免疫球蛋白IgG1Fc段融合基因的重组2型腺相关病毒(rAAV2/hTNFR:Fc),并对其生物学活性进行研究。以RT-PCR分别从U937和人淋巴细胞总RNA中扩增人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和人免疫球蛋白IgG1Fc段基因,并以重叠延伸PCR的方法将二者融合后克隆入pSNAV1载体质粒进行重组病毒生产,在进行重组病毒理化分析后,以TNFα细胞毒中和试验来研究该重组病毒的生物学活性。结果显示:所构建的重组病毒rAAV2/hTNFR:Fc基因结构与预期一致;病毒在体外感染BHK-21细胞后,含TNFR:Fc融合蛋白的表达上清可以有效中和人、大鼠、小鼠TNFα对L929的细胞毒性。所研究构建的重组腺相关病毒可以用来作为阻断TNFα的手段,进行类风湿性关节炎的基因治疗研究。
- 高凯赵爱志吴小兵药力波张英起王军志
- 关键词：腺相关病毒基因治疗肿瘤坏死因子生物学活性类风湿性关节炎
- 重组腺相关病毒载体介导成纤维细胞生长因子2基因诱导缺血心肌血管新生被引量：4
- 2004年
- 探讨重组 2型腺相关病毒载体介导 2型成纤维细胞生长因子基因诱导家兔缺血心肌血管生成的作用。实验对象为 2 0只新西兰兔 ,手术建立心肌缺血模型后随机分为成纤维细胞生长因子基因治疗组和对照组 ,分别向缺血区域心肌注射成纤维细胞生长因子腺相关病毒或磷酸盐缓冲液。 4周后取心肌及肝、肾等器官组织标本 ,采用逆转录聚合酶链反应检测目的基因mRNA的表达 ;制作组织学切片以观察组织病理改变 ,于高倍镜下计数缺血区域微血管数目。结果发现转染的 2型成纤维细胞生长因子基因在缺血心肌中有表达 ,成纤维细胞生长因子基因治疗组缺血区域单个高倍视野内的微血管数为 12 .0± 1.4条 ,对照组为 4 .5± 1.5条 ,二者差异具有显著性 (P <0 .0 1)。 2型成纤维细胞生长因子基因治疗组的肝脏、肾脏、脾脏、角膜和睾丸标本中均未发现 2型成纤维细胞生长因子基因的表达 ,病理检查也未发现组织结构异常。说明腺相关病毒载体介导的 2型成纤维细胞生长因子基因可以有效地转染入家兔缺血心肌 ,并具有明显的诱导缺血心肌血管生成的作用 ,且基因表达仅限于心肌。
- 袁洪黄志军吴小兵彭建强闾宏伟阳国平唐晓鸿
- 关键词：病理学与病理生理学腺相关病毒成纤维细胞生长因子缺血心肌血管新生
- 重组腺相关病毒载体介导人型血管内皮生长因子基因对缺血心肌血管新生的影响
- 目的探讨重组2型腺相关病毒(rAAV-2)载体介导的人型血管内皮生长因子165(hVEGF165)基因对兔缺血心肌血管生成的影响。方法实验对象为50只新西兰兔,随机选取10只作为正常对照组,其余家兔建立心肌缺血模型。建模...
- 黄志军袁洪曾钧发吴小兵彭建强易斌
- 文献传递
- 腺相关病毒载体介导的人凝血因子Ⅸ基因在CD34^+造血干/祖细胞中的表达
- 2005年
- 目的研究2型重组腺相关病毒(rAAV-2)介导的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)基因在脐血CD34+细胞及其子代细胞中的表达。方法采用rAAV-2/hFⅨ转导经预刺激的人脐血CD34+细胞,分别向粒单系、巨核系和红系分化培养21d,从转录水平、蛋白质水平和其功能活性检测hFⅨ的表达,同时检测子代细胞的活力、增殖倍数、各系标志分化抗原的表达及集落产率来评估rAAV-2对其增殖分化能力的影响。结果经测序证实转导组子代细胞的RNA可扩增出hFⅨcDNA片段,上清液中可检测到hFⅨ抗原的表达,每24h分泌量达14.10ng/106细胞。转导组和未转导组细胞培养21d后其活力、增殖倍数、标志性分化抗原的阳性率及集落产率差异均无统计学意义(P值均>0.05)。结论rAAV-2/hFⅨ能有效地转导人脐血CD34+细胞并在其子代细胞中表达具有凝血活性的hFⅨ,且对其体外培养21d的细胞增殖分化能力无明显影响。
- 陈焱陈方平彭建强吴小兵王光平蹇在伏信红亚吴新华
- 关键词：CD34^+造血干/祖细胞病毒载体介导脐血CD34^+细胞2型重组腺相关病毒
- 靶向hVEGF165基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选
- 2008年
- 目的构建编码hVEGF165mRNA的shRNA质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体。方法以hVEGF165mRNA编码区中第5和第7外显子序列作为RNA干扰靶点,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体并通过PCR进行鉴定。经鉴定后分别转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞,实时荧光定量PCR和Western blotting分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果。结果构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出预期条带,构建成功。靶向hVEGF165基因的shRNA对所转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞中hVEGF165基因mRNA和蛋白质表达均有抑制作用,其中shRNA2最为明显。结论成功构建了靶向hVEGF165基因的shRNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2质粒。
- 王卫东蒋立新徐江平陆兵勋
- 关键词：RNA干扰
- 重组腺相关病毒Ⅰ型/大鼠肿瘤坏死因子受体:Fc(rAAVⅠ/ratTNFR:Fc)的构建和在大鼠体内表达的初步研究
- 2005年
- 目的 构建携带大鼠肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和大鼠免疫球蛋白IgG1Fc段融合基因的重组Ⅰ型腺相关病毒(rAAVⅠ/ratTNFR :Fc) ,并对该病毒在Lewis大鼠体内的表达和生物学活性进行初步研究,探讨以该重组腺相关病毒载体应用于类风湿关节炎基因治疗的可行性。方法 首先以RT- PCR分别从大鼠脾细胞和大鼠淋巴细胞总RNA中扩增出大鼠肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和大鼠免疫球蛋白IgG1Fc段基因,并以重叠延伸PCR的方法将二者融合后克隆入pSNAVⅠ载体质粒进行重组病毒生产。在获得重组病毒后于Lewis大鼠肌肉注射,于不同时间ELISA测定血清ratTNFR :Fc表达,并以TNF -α细胞毒中和实验测定重组病毒表达产物的生物学活性。结果 所构建的重组病毒rAAVⅠ/ratTNFR :Fc基因结构与预期一致;病毒于Lewis大鼠肌肉注射后可表达ratTNFR :Fc蛋白,含有ratTNFR :Fc蛋白的血清可以有效中和大鼠TNF- α对L92 9细胞的杀伤作用。结论 本研究所构建的携带大鼠肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和大鼠免疫球蛋白IgG1Fc段融合基因的重组Ⅰ型腺相关病毒(rAAVⅠ/ratTNFR :Fc)可以用来作为阻断TNF α的手段于大鼠类风湿关节炎模型上进行基因治疗研究。
- 高凯赵爱志吴小兵药力波张英起王军志
- 关键词：腺相关病毒肿瘤坏死因子
- 2型重组腺相关病毒对脐血CD34^+造血干/祖细胞的转导条件的优化
- 2006年
- 目的:探索不同转导条件下2型重组腺相关病毒(rAAV-2)/绿色荧光蛋白(GFP)对人脐血CD34+细胞的转导效率。方法:人脐血CD34+细胞分别以IL-3加IL-6加干细胞因子(SCF)加Flt3配体(FL)(预刺激1组)或SCF加FL加血小板生长因子(预刺激2组)预刺激48 h后,转导rAAV-2/GFP,转导后2 d和7 d收集细胞,流式细胞仪检测GFP的表达,同时以金黄地鼠胚胎肾细胞(BHK-21)细胞作为阳性对照。结果:感染复数(MOI)为2×105病毒基因组(v.g)/cell时,rAAV-2/GFP能有效地转导CD34+细胞,2 d的GFP阳性率可达(28.05±4.47)%(S/F/T组),(27.44±4.99)%(3/6/S/F组),最高达43.36%,随着培养时间的延长,GFP表达有下降的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。预刺激1组、预刺激2组与无预刺激组的GFP阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.05),预刺激1组与预刺激2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:MOI 2×105v.g/cell时,采用细胞因子预刺激可得到rAAV-2/GFP对人脐血CD34+细胞的有效转导,但本实验采用的2种预刺激条件对转导效率的提高没有明显区别。
- 陈焱陈方平王光平彭建强吴小兵吴新华
- 关键词：脐血造血祖细胞基因转导
