潍坊医学院基础医学院山东省高校免疫学重点实验室
- 作品数：50 被引量：53H指数：4
- 相关作者：王焕芹张素华吴慧娜付晓燕刘艳艳更多>>
- 相关机构：山东大学齐鲁医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金山东省科技攻关计划教育部科学技术研究重点项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学文化科学更多>>
- 小鼠IL-1β在H22细胞的表达及对NK细胞杀伤活性的影响被引量：5
- 2007年
- 目的:重组表达小鼠IL-1β全长基因,转染H22肝癌细胞,分析对NK细胞杀伤活性的影响。方法:构建小鼠IL-1β重组表达载体pIRES2-EGFP-mIL-1β,利用jetPEI转染H22肝癌细胞,RT-PCR和激光扫描共聚焦显微镜分析IL-1β重组载体的表达,MTT方法分析转染前后,野生型小鼠脾脏NK细胞对H22细胞杀伤活性的变化。结果:RT-PCR扩增出小鼠IL-1β,长度约843bp。纯化的PCR产物与pIRES2-EG-FP同时经XhoI和EcoRI双酶切,在T4连接酶作用下连接,转化大肠杆菌,提取质粒经PCR、限制性酶谱分析(XhoI+EcoRI)和DNA序列测定后,确认获得重组表达载体pIRES2-EGFP-mIL-1β。将该质粒转染至H22小鼠肝癌细胞中,RT-PCR和荧光观察证实,H22细胞能表达高水平IL-1β重组表达载体,与转染空载体的对照组细胞相比,IL-1β转基因后H22细胞对NK92细胞杀伤抵抗性明显增强,同时野生型小鼠脾脏NK细胞对pIRES2-EGFP-mIL-1β转基因细胞的杀伤活性明显下降,效靶比40:1时下降了约10%。结论:IL-1β能够明显增强H22肝癌细胞对NK细胞杀伤的抵抗性,可能是肝癌细胞借以逃逸天然免疫应答的重要机制。
- 肖伟玲梁淑娟牟东珍王雪净吴慧娜
- 关键词：IL-1ΒNK细胞天然免疫肝癌
- 以hsa-miR-491-3p为靶标的反义寡核苷酸对NCI-H446细胞生物学特性的影响被引量：3
- 2011年
- 背景与目的:miRNAs是一类小分子RNA,参与转录后调控。前期研究结果显示,hsa-miR-491-3p在肺癌和肾癌组织中高表达,目前鲜见其功能研究的报道。本研究旨在探讨以hsa-miR-491-3p为靶标的反义寡核苷酸对人小细胞肺癌NCI-H446细胞生物学特性的影响。方法:合成以hsa-miR-491-3p为靶标的反义寡核苷酸和随机对照序列,转染NCI-H446细胞。实验分4组:空白对照组(组1)、空白转染组(组2)、随机对照组(组3)和反义寡核苷酸组(组4)。用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法筛选最佳作用浓度,Hoechst33258染色检测细胞核的形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡和周期变化,划痕实验检测细胞的迁移能力。结果:转染反义寡核苷酸后细胞生长受到抑制,最佳作用浓度为0.5μmol/L。Hoechst33258染色各组的凋亡率分别为(6.67±0.58)%、(7.00±1.00)%、(6.67±1.53)%和(26.33±1.53)%,组4的凋亡率明显高于前3组,差异有统计学意义(P<0.001)。流式细胞仪检测各组的凋亡率分别为(2.44±0.60)%、(2.59±0.85)%、(2.62±1.11)%和(5.22±0.40)%,组4的凋亡率明显高于前3组,差异有统计学意义(P<0.01),且G1期细胞增多,S期细胞减少。划痕实验显示各组细胞24 h的迁移距离分别为(196.88±39.13)、(163.06±21.28)、(225.49±23.42)和(77.41±6.07)μm,组4细胞的迁移距离小于前3组(P<0.05),迁移能力减弱。结论:以hsa-miR-491-3p为靶标的反义寡核苷酸能够抑制NCI-H446细胞增殖,诱导其凋亡,并降低其侵袭能力。
- 官士珍付玉荣伊正君李猛裴景亮高昆山
- 关键词：反义寡核苷酸NCI-H446细胞
- BCSC-1过表达抑制肝癌Bel-7402细胞的增殖、侵袭、黏附和迁移
- 2013年
- 目的:研究人乳腺癌候选抑癌蛋白1基因(breast cancer suppressor candidate 1,BCSC-1)过表达对肝癌Bel-7402细胞的增殖、侵袭、黏附和迁移的影响,并探讨其可能的机制。方法:将pcDNA3.1/v5-HisB-BCSC-1和空质粒pcDNA3.1/v5-HisB转染的Bel-7402细胞作为BCSC-1组和空载体组,Bel-7402细胞为野生型组。MTT法、Transwell实验、体外黏附实验和划痕实验分别检测BCSC-1过表达对Bel-7402细胞增殖、侵袭、黏附和迁移的影响,Real-time PCR检测BCSC-1过表达对Bel-7402细胞中与细胞增殖、黏附相关的ICAM-1、PTTG、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)mRNA表达的影响。结果:转染pcDNA3.1/v5-HisB-BCSC-1后Bel-7402细胞中BCSC-1 mRNA的表达水平显著高于空载体组和野生组细胞[(10.58±0.56)vs(1.10±0.22)、(1.00±0.01),均P<0.01],成功制备BCSC-1稳定过表达的Bel-7402细胞株。与空载体组和野生型组相比,BCSC-1组Bel-7402细胞生长速度明显减慢[72 h:(0.29±0.003)vs(0.34±0.014)、(0.35±0.013),均P<0.05];侵袭率[(76.20±1.85)%vs(93.42±3.24)%、(100.00±1.05)%,均P<0.01)]、黏附率[(58.57±0.84)%vs(97.14±0.84)%、(100.00±1.30)%,均P<0.01]显著降低,迁移距离显著降低[(116.60±10.58)vs(231.33±10.26)、(237.96±11.58)μm,均P<0.01];同时过表达BCSC-1的Bel-7402细胞的OPN mRNA表达量明显降低[(0.12±0.06)vs(0.95±0.14)、(1.00±0.08),均P<0.01],ICAM-1、PTTG mRNA表达无明显变化。结论:BCSC-1过表达能够抑制Bel-7402细胞的增殖、侵袭、黏附和迁移能力,其机制可能与OPN基因表达下降有关。
- 田俊芳邸大琳王洪伟巩方郇雪洁鞠吉雨
- 关键词：肝癌BEL-7402细胞迁移
- 抑癌基因BCSC-1原核表达载体的构建及诱导表达
- 2010年
- 目的 构建BCSC-1基因原核表达载体并进行诱导表达、纯化.方法 PCR方法从腺病毒穿梭载体pDC316-BCSC-1扩增BCSC-1基因,构建原核表达载体ET30a-BCSC-1,转化感受态E.coli BL21（DE3）,并用IPTG进行诱导表达.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法检测目的 蛋白的表达,并用超声洗涤方法进行目的 蛋白洗涤纯化.结果 成功构建原核表达载体pET30a-BCSC-1;在IPTG诱导下在E.coli BL21（DE3）中高效表达相对分子质量（Mr）为86 000的重组BCSC-1蛋白,目的 蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中,经超声洗涤纯化后,重组蛋白纯度可达85%以上.结论 利用构建的原核表达载体成功表达出BCSC-1蛋白,为进一步制备抗BCSC-1的单克隆抗体及在临床中的应用打下良好基础.
- 袁芳鞠吉雨王丽娜邸大琳刘艳菲冯永堂
- 关键词：原核表达
- IL-32原核表达载体的构建及表达
- 2010年
- 目的构建人IL-32原核表达载体，并进行初步诱导表达。方法PCR扩增IL-32基因并将其与原核表达质粒pET32a（＋）连接，重组pET32a—IL-32经PCR、酶切及测序鉴定后转入表达菌株BL21（DE3）进行融合蛋白的少量诱导表达，SDS—PAGE和Westem Blotting检测目的蛋白表达及水平。结果含有重组质粒的表达菌株经IPTG诱导后获得高效表达，融合蛋白主要存在于包涵体中，重组蛋白表达水平占总蛋白的27．5％；Western Blotting分析表明该蛋白可与特异性抗体发生结合。结论构建了人IL-32基因的原核表达载体，获得IL-32融合蛋白。
- 祝仁军林志娟牟东珍肖伟玲梁淑娟
- 关键词：原核表达
- 小鼠IL-35基因的克隆及原核表达被引量：2
- 2010年
- 目的克隆小鼠mlL-35两亚基mEBI3，mlL-12p35cDNA，并构建mlL-35基因的原核表达载体并进行诱导表达。方法RT—PCR方法从RAW246．7细胞中扩增mEBI3基因及脂多糖体外刺激BALB／c小鼠的脾细胞中扩增mlL-12p35基因，通过重叠PCR方法扩增出mEBI3-Linker-mlL-12p35基因，并构建原核表达载体pET-30a．mlL-35，转化感受态E．coliBL21（DE3），并用IPTG进行诱导表达。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法检测目的蛋白的表达。结果成功克隆了mEBI3、mlL-12p35cDNA，通过重叠PCR方法扩增出mEBI3-Linker—mlL-12p35片段，并构建出原核表达载体pET-30a-mlL-35；在IPTG诱导下在E．coliBL21（DE3）中高效表达相对分子质量（Mr）为50000的重组mlL-35蛋白，目的蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中。结论利用构建的原核表达载体pET-30a-mlL-35成功表达出mlL-35蛋白，为进一步探讨mlL-35的生物学功能奠定了基础：
- 唐媛媛鞠吉雨朱平王丽娜林志娟邸大琳苗乃法
- 关键词：原核表达
- 胸腺基质淋巴细胞生成素的研究进展
- 2010年
- 胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）是1994年被发现的一种IL-7样细胞因子,该因子对树突状细胞（DC）活化和诱导淋巴细胞及其亚群的分化、成熟有着重要的调控作用.近年来TSLP倍受关注,大量研究证实其对Th2和调节性T细胞（Treg）的分化成熟具有重要影响,并参与支气管哮喘、过敏性皮炎、过敏性鼻炎等变态反应性疾病的发生发展,因而研究其机制具有重要意义.
- 徐灵芝冯永堂
- 关键词：胸腺基质淋巴细胞生成素树突状细胞过敏性炎症调节性T淋巴细胞
- 人OX40融合蛋白的表达及其纯化
- 2009年
- 目的表达含有人OX40胞外段的融合蛋白,纯化目的蛋白,为下一步制备抗人OX40单克隆抗体及鉴定打下良好的基础。方法采用冰冷热击法将测序正确的pET32a-OX40胞外段的重组质粒转入表达菌株BL2l(DE3)的感受态细胞,接种于含氨苄青霉素的培养基筛选出阳性克隆。将阳性克隆细菌用IPTG诱导培养,收集不同时间的培养产物,离心分离菌体,取菌体超声破菌,离心收集胞质上清和包涵体沉淀,进行SDS-PAGE分析,观察不同时间条件对目的蛋白表达的影响及目的蛋白分布情况,筛选优化表达条件。采用Ni离子亲合层析柱纯化目的蛋白,然后使用超滤管对蛋白进行脱盐处理,并用核酸蛋白检测仪测定目的蛋白的浓度。结果筛选到表达pET32a-OX40的阳性菌株SDS-PAGE电泳表明,含有重组质粒的表达菌株经IPTG诱导后,在蛋白Marker的31.0～42.7kD之间出现了新的融合蛋白带,在胞质和包涵体中均有目的融合蛋白的表达。优化表达条件分析表明,在诱导的不同时间内新蛋白的表达量没有明显差别用Ni离子亲和层析柱纯化的蛋白经超滤管进行脱盐处理后,获得的目的蛋白含量为56.266g/L。结论成功获得表达pET32a-OX40的阳性菌株;
- 辛宁冯永堂冷雪娇王成伟鞠吉雨苗乃法
- 关键词：纯化单克隆抗体
- siRNA阻断NF-κB通路抑制HepG2细胞增殖及NK杀伤抵抗性
- 2009年
- 目的利用小干扰RNA(siRNA)阻断肝癌细胞HepG2中的NF-κB信号通路,研究其对肝癌细胞增殖活性及NK杀伤敏感性的影响。方法利用NF-κB p65 siRNA转染HepG2细胞,48h后分别进行Western blotting及ELISA检测NF-κB p65蛋白的表达;MTT法检测转染后细胞的增殖变化及对NK-92细胞杀伤敏感性的变化。结果转染NF-κB p65 siRNA后肝癌细胞中NF-κB p65蛋白表达的水平明显下降;MTT检测发现,与对照组相比,NF-κB p65 siRNA能够明显抑制HepG2细胞的增殖活性,同时使其对NK-92细胞介导的杀伤敏感性增加(P<0.05)。结论siRNA阻断NF-κB通路能够抑制肝癌细胞增殖及对NK细胞杀伤的抵抗性。
- 刘艳艳孙萍梁淑娟
- 关键词：SIRNANF-ΚB增殖
- 人类CD252基因片段在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫原性分析
- 2009年
- 目的优化表达含人类CD252胞外段的融合蛋白,纯化目的蛋白,为单克隆抗体的制备打下良好的基础。方法将测序正确的pET32a(+)-CD252胞外段重组质粒转入表达菌株BL21感受态细菌中,用SDS-PAGE电泳鉴定重组菌的诱导表达情况,通过改变pET32a(+)-CD252阳性菌株的诱导时间、温度,以优化出最佳表达条件。采用包涵体纯化法纯化目的蛋白。用纯化的重组蛋白免疫BalB/C小鼠,采用ELISA法测定血清中抗体效价。结果成功获得表达pET32a(+)-CD252的阳性菌株。转化有pET32a(+)-CD252胞外段重组质粒的表达菌经IPTG诱导后,在蛋白分子量标准的31.0～42.7kD之间出现了新的蛋白条带,新的蛋白主要存在于包涵体中。优化表达条件分析表明,在诱导4h、温度37 ℃、IPTG浓度为1.0mmol/L时,融合蛋白的表达量最高。包涵体洗涤纯化后,经SDS-PAGE电泳证明可得到较纯的目的蛋白。免疫小鼠后测得的平均抗体效价为1:3200。结论pET32a(+)-CD252胞外段原核表达载体能够表达CD252蛋白,并获取了目的蛋白的优化表达条件,表达蛋白具有良好的免疫原性。
- 王成伟潘新宇冯永堂辛宁鞠吉雨苗乃法
- 关键词：融合蛋白纯化单克隆抗体免疫原性
