对实验室前期Solexa结果进行深入挖掘,结合生物信息学分析从不同发育阶段猪皮下脂肪组织差异表达的miRNAs中筛选出高丰度差异极显著的候选miR-191.采用腺病毒过表达miR-191,实时定量PCR、Western blot及双荧光素酶报告基因检测等技术方法,初步研究miR-191对猪前体脂肪细胞分化的影响.结果发现,miR-191随着猪前体脂肪细胞的分化表达量逐渐增加.与对照组相比,过表达miR-191的猪前体脂肪细胞中miR-191转录本显著增加,并引起CCAAT增强子结合蛋白β(C/EBPβ)、PPARγ和aP2的mRNA水平降低,抑制了猪前体脂肪细胞分化.同时,Western blot结果显示,与对照组相比过表达miR-191的猪前体脂肪细胞在48 h C/EBPβ蛋白水平下降了55%.更重要的是,通过TargetScan等算法正向筛选以及MicroInspector反向筛选联合获得miR-191候选靶基因,经双荧光素酶报告基因检测结果证实,miR-191可直接作用于C/EBPβ3′UTR,从而降低萤火虫荧光素酶活性.综上所述,miR-191可能通过抑制脂肪细胞分化早期标志基因C/EBPβ的表达,从而抑制了猪前体脂肪细胞的分化.
【目的】探讨慢病毒介导的shRNA干扰系统抑制脱乙酰基酶1(Sirtuin type 1,Sirt1)表达对猪前体脂肪细胞凋亡的影响。【方法】构建pLentiH1-Sirt1shRNA慢病毒载体,将其感染猪前体脂肪细胞,运用Hoechst33258染色,于荧光显微镜下观察细胞的形态学变化;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western印迹检测细胞凋亡标志物Cleaved caspase-3的表达情况。【结果】pLentiH1-Sirt1shRNA慢病毒载体可抑制猪前体脂肪细胞中Sirt1的表达,显微镜下可见细胞体积缩小、染色质凝集、核固缩等典型的凋亡特征;流式细胞术显示细胞凋亡率较空载体对照组明显增加,早期和晚期凋亡细胞百分率分别从4%和9%(P<0.05)上升至30%和32%(P<0.05);Western印迹检测显示Cleaved caspase-3蛋白表达水平显著上调。【结论】慢病毒介导的shRNA可有效地抑制猪前体脂肪细胞中Sirt1的表达,显著促进细胞凋亡,提示Sirt1可能在前体脂肪细胞凋亡中发挥着重要作用。
