重庆医科大学检验医学院临床血液学教研室
- 作品数：10 被引量：20H指数：2
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- FABD结构域缺失削弱293T细胞BCR/ABL癌蛋白抗凋亡能力
- 2018年
- 目的通过转染野生型p Ad-Bcr/Abl及缺失突变型p Ad-BCR/ABL-ΔFABD于293T细胞中,探讨FABD结构域对Bcr/Abl癌蛋白抗凋亡能力的影响及相关机制。方法 293T细胞分别转染野生型p Ad-Bcr/Abl及缺失突变型p Ad-Bcr/Abl-ΔFABD质粒,并设置Blank组和Adtrack组作为对照,分别培养24、48、72 h后,采用流式细胞术(FCM)检测转染荧光强度并筛选最佳转染条件,Western blot验证蛋白表达。采用WST-1(水溶性四唑盐)实验及FCM检测FABD结构域对BCR/ABL癌蛋白促增殖抗凋亡能力的影响;DAPI染色观察细胞核形态变化;Western blot分别检测p-bcr/abl、p-AKT、p-ERK表达及凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP蛋白活化情况。结果 FCM检测结果显示质粒转染效率呈时间依赖性增加,并选择48 h为最佳转染时间。Western blot结果证实已经成功构建野生型p Ad-Bcr/Abl及缺失突变型p Ad-Bcr/Abl-ΔFABD质粒。WST-1实验及FCM检测结果显示,FABD结构域缺失可显著抑制细胞增殖并促进凋亡,在处理48 h后细胞凋亡数达到29.0%(P<0.05);在FABD结构域缺失后,p-AKT、p-ERK表达显著下调;凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP均在48 h明显活化。结论 FABD结构域缺失可显著削弱BCR/ABL癌蛋白促增殖抗凋亡能力,其可能与下调AKT、ERK信号通路并激活线粒体凋亡途径有关。
- 周芳竹黄峥兰骆贞红王腾冯文莉
- 关键词：BCR/ABL
- 腺病毒介导的AIF及其突变体对K562细胞凋亡的影响被引量：2
- 2015年
- 目的构建凋亡诱导因子(Ad-AIF)及其突变体的重组腺病毒(Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF),观察其对白血病K562细胞凋亡的影响。方法扩增AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF片段,分别克隆至p Ad-TrackCMV-HA质粒中,经过PCR、双酶切和测序鉴定后,分别与p Ad-Easy1质粒重组得到腺病毒质粒,经包装和扩增后得到腺病毒,以无外源序列的腺病毒作为空载腺病毒。Western blot验证重组腺病毒在K562细胞中的表达,免疫共沉淀检测AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF是否与HSP70相结合,Hoechst33258染色和流式细胞术检测AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF对K562细胞凋亡的影响。结果重组腺病毒构建成功,能够在K562细胞中表达;AIF和DMLS-AIF与HSP70相结合,DHBD-AIF不结合HSP70;Ad-DHBD-AIF引起K562细胞染色质凝集,而Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF处理的K562细胞染色质分布均匀;Ad-DHBD-AIF引起K562细胞凋亡数明显高于Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF(P<0.05)。结论成功构建了腺病毒Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF,其中Ad-DHBD-AIF对K562细胞的凋亡影响明显高于Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF,为K562细胞凋亡受阻的进一步研究奠定了基础。
- 代安亚王方冯文莉
- 关键词：凋亡诱导因子细胞凋亡腺病毒载体K562细胞
- SH2-ODC/AZ1腺病毒的构建及对BCR-ABL蛋白的降解效应
- 2015年
- 目的构建重组腺病毒Ad-SH2-ODC和Ad-AZ1,检测共表达SH2-ODC和AZ1蛋白对BCR-ABL癌蛋白的降解效应。方法PCR扩增src同源结构域2(src homology 2,SH2)、鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)及抗酶蛋白1(antizyme 1,AZ1)基因,构建携带SH2-ODC(SO)或AZ1基因的p Ad Track-CMV腺病毒穿梭质粒,经双酶切和测序鉴定后与腺病毒骨架质粒p Ad Easy-1同源重组,获得重组腺病毒质粒。后者经PacⅠ酶切鉴定后,在人胚肾细胞系AD293中包装、扩增,获得重组腺病毒;腺病毒Ad-SO和Ad-AZ1共感染人白血病细胞系K562,western blot检测目的蛋白的表达。结果双酶切和测序证实,腺病毒穿梭质粒构建正确;PacⅠ酶切结果显示,重组腺病毒质粒构建成功;western blot证实目的蛋白在K562细胞中表达正确,共表达SO和AZ1可以降低BCR-ABL蛋白水平。结论成功构建了Ad-SO和Ad-AZ1重组腺病毒,共表达SO和AZ1可以降解K562细胞中的BCR-ABL蛋白。
- 徐敏高淼黄峥兰陶崑钟梁冯文莉
- 关键词：SH2结构域鸟氨酸脱羧酶
- Trx-DMLS-AIF融合蛋白的原核表达及其对白血病K562细胞脱细胞系统的影响
- 2015年
- 目的 :原核表达硫氧化还原蛋白-缺线粒体定位信号的凋亡诱导因子融合蛋白(thioredoxin-apoptosis-inducing factor-defected mitochondria localization sign,Trx-DMLS-AIF),并观察其对白血病K562细胞脱细胞系统的影响。方法 :构建表达融合蛋白Trx-DMLS-AIF的重组载体并将其转化至大肠埃希菌BL21中,应用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导融合蛋白Trx-DMLS-AIF的表达,并进行Ni-NAT柱亲和层析法纯化。建立白血病K562细胞的脱细胞系统,应用吖啶橙染色法观察Trx-DMLS-AIF对白血病K562细胞脱细胞系统的影响;免疫荧光染色法观察K562细胞质蛋白对Trx-DMLS-AIF进入细胞核的影响。结果 :IPTG成功诱导融合蛋白Trx-DMLS-AIF的表达,并获得纯化的Trx-DMLS-AIF蛋白。吖啶橙染色后发现,Trx-DMLS-AIF能够诱导脱细胞系统K562细胞核凋亡;免疫荧光染色后发现,K562细胞质蛋白可阻止Trx-DMLS-AIF蛋白进入细胞核。结论 :成功诱导融合蛋白Trx-DMLS-AIF的表达。Trx-DMLS-AIF可引起K562细胞核凋亡,K562细胞质蛋白可阻止Trx-DMLS-AIF进入细胞核。
- 代安亚王方冯文莉
- 关键词：白血病凋亡诱导因子重组融合蛋白质类原核表达
- 在医学检验本科开设'临床输血学检验'的教学探讨
- 在过去的20年里由于大手术数量上的增加以及在恶性肿瘤治疗方法上的进步使血制品的需求也随之增加.因此,如何安全输血和合理使用血液资源,已经成为临床输血的重要内容.为适应医学教育新的需求,重庆医科大学检验医学院临床血液学教研...
- 王晶张伶陈婷梅冯文莉黄峥兰蔡晓钟
- 关键词：高等教育医学检验专业课程设置
- 文献传递
- 抗慢性粒细胞白血病细胞人源化单链抗体的原核表达及其活性被引量：1
- 2012年
- 目的原核表达抗慢性粒细胞白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML)细胞人源化单链抗体(Humanized sin-gle-chain variable fragment,hscFv),并检测其抗原结合活性。方法从重组质粒pUC57-hscFv中扩增hscFv基因,插入含6×His标签的原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a-hscFv,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组融合蛋白经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,SDS-PAGE分析其纯度;Western blot分析其反应原性;间接免疫荧光试验检测其抗原结合活性。结果重组表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约为46 000,表达量约占菌体总蛋白的37%,主要以可溶性形式存在;纯化的重组融合蛋白纯度为94%,可与鼠抗6×His单抗及K562细胞表面抗原特异性结合。结论成功原核表达并纯化了抗CML细胞hscFv,为其进一步应用于CML的临床分子诊断和生物靶向治疗奠定了基础。
- 朱小影王东李身锋张利军钟梁冯文莉
- 关键词：慢性粒细胞白血病人源化抗体原核细胞
- 在医学检验本科开设《临床输血学检验》的教学探讨被引量：7
- 2014年
- 在过去的20年里由于大手术数量上的增加以及在恶性肿瘤治疗方法上的进步使血制品的需求也随之增加。因此，如何安全输血和合理使用血液资源，已经成为临床输血的重要内容。为适应医学教育新的需求，重庆医科大学检验医学院临床血液学教研室于2010年起针对检验专业本科生开设了新的特色课程——《临床输血学检验》，本课程的开展将进一步完善检验专业同学输血检验方面的知识。
- 王晶张伶陈婷梅冯文莉黄峥兰蔡晓钟
- 关键词：临床输血学本科生教学肿瘤治疗方法临床血液学
- 藏药桃儿七可促进慢性粒细胞白血病K562细胞的凋亡被引量：7
- 2017年
- 目的探讨藏药桃儿七对慢性粒细胞白血病K562细胞凋亡的影响及相关机制。方法用不同浓度的桃儿七对K562细胞株进行不同时间梯度的处理,应用CCK8试验筛选桃儿七的最佳作用浓度及时间;流式细胞术检测细胞凋亡;瑞氏染色观察细胞形态学改变,DAPI染色观察细胞核形态变化;Western blotting分别检测凋亡相关蛋白PARP、caspase-3、Cleaved-caspase3的活化情况以及BCR/ABL、p-BCR/ABL、STAT5、p-STAT5蛋白表达变化。结果分别以1、2、3μg/m L浓度的桃儿七处理细胞12、24、36、48、72、96 h,K562细胞增殖呈浓度时间依赖性抑制,并筛选出2μg/m L,48 h为最佳处理方式。流式细胞术检测结果显示凋亡细胞数量呈时间依赖性增加,并在48 h凋亡最为显著;凋亡相关蛋白PARP、caspase-3以及Cleaved-caspase-3均呈时间依赖性活化。以2μg/m L桃儿七处理细胞48 h后,K562细胞形态发生不规则改变,出现核碎裂、溶解等凋亡特征;BCR/ABL、pBCR/ABL、STAT5、p-STAT5表达显著降低。结论藏药桃儿七能够促进慢性粒细胞白血病K562细胞凋亡,其机制可能通过抑制BCR/ABL-STAT5信号通路并激活线粒体凋亡途径来实现。
- 周芳竹王欣代安亚黄峥兰李会黄宁姝冯文莉
- 关键词：慢性粒细胞白血病BCR/ABL凋亡
- CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽对白血病K562细胞裸鼠皮下移植瘤的作用被引量：1
- 2013年
- 目的:探讨细胞质转导肽-寡聚化结构域1-血凝素(cytoplasmic transduction peptide-oligomerization domain 1-hemagglutinin,CTP-OD1-HA)和CTP-OD2-HA融合肽对白血病K562细胞裸鼠皮下移植瘤的作用。方法:CTP-OD-HA(阳性对照)、CTP-HA(阴性对照)、PBS(空白对照)、CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA分别预处理K562细胞,并将其分别注射入裸鼠皮下,观察裸鼠皮下移植瘤的生长情况,TUNEL法检测移植瘤组织中肿瘤细胞的凋亡,免疫组织化学法检测肿瘤组织中凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达情况。结果:CTPOD1-HA和CTP-OD2-HA处理组移植瘤体积明显小于CTP-HA组(P<0.05),且肿瘤细胞内出现空泡样凋亡改变。TUNEL法检测结果显示,CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA处理组肿瘤细胞的凋亡改变比CTP-HA组更明显(P<0.05)。CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA处理组肿瘤组织中凋亡相关蛋白Bax蛋白的表达水平明显高于CTP-HA组(P<0.05),而Bcl-2蛋白的表达水平明显低于CTP-HA组(P<0.05)。结论:CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽能够抑制K562细胞在裸鼠体内的致瘤能力,并促进肿瘤细胞凋亡。
- 肖恒王海霞陶崑钟梁黄世峰冯文莉
- 关键词：白血病
- 抗CML单链免疫毒素载体的构建、表达及活性鉴定被引量：2
- 2013年
- 目的:构建单链免疫毒素hscFv-ETA'的原核表达载体,经表达后鉴定其对CML细胞的特异性杀伤作用。方法:采用亚克隆技术,首先将hscFv与截短的假单胞菌外毒素基因ETA'通过酶切及连接反应,在载体pWW20上构建hscFvETA'单链免疫毒素基因;再将其亚克隆入pET32a(+)原核表达载体中,转化BL21(DH3)宿主菌,IPTG诱导表达;SDS-PAGE观察其表达水平并建立目的蛋白的纯化方法,Western blot鉴定纯化的目的蛋白,FCM鉴定融合蛋白hscFv-ETA'与细胞结合的活性以及诱导细胞凋亡的能力。结果:限制性酶切图谱和序列分析证实,在pET32a(+)原核表达载体上成功地构建了hscFvETA'单链免疫毒素载体;该基因在pET32a(+)载体中获得高效表达,表达产物的相对分子质量与预期值相符;经Western blot鉴定证实纯化后的重组免疫毒素hscFv-ETA'融合蛋白是正确的;经FCM证实hscFv-ETA'蛋白能特异性结合CML细胞并诱导细胞凋亡。结论:已成功构建并原核表达单链免疫毒素hscFv-ETA',证明该蛋白能发挥特异性结合并诱导CML细胞凋亡。
- 朱小影陶崑李身锋张利军李亚娟王东钟梁冯文莉
- 关键词：慢性粒细胞白血病重组免疫毒素
