丛延广
- 作品数：85 被引量：228H指数：9
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- 利用转座子建立细菌单基因突变株库的策略和方法
- 2008年
- 构建细菌突变株是认识细菌基因功能的一个重要途径。如果针对某个细菌建立一个包括所有基因的单基因突变株库,对于该细菌基因功能的认识无疑具有巨大的推动作用。本文综述了利用转座子建立细菌突变株库的工作,并侧重于其构建策略和方法。
- 丛延广胡福泉
- 关键词：转座子突变株
- pQE-EGFP原核表达载体的构建及其表达和鉴定被引量：4
- 2008年
- 目的:利用分子克隆技术构建原核表达载体pQE-EGFP,在大肠埃希菌中高效表达与鉴定。方法:以质粒pEGFP-N2为模板,采用PCR方法特异性扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列,将其克隆于原核表达载体pQE-31,所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109,用异丙基巯基半乳糖(IPTG)诱导表达;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting鉴定表达蛋白质。结果:PCR扩增得到了EGFP全长结构基因。所构建的pQE-EGFP重组质粒经酶切及测序鉴定结果与设计序列一致;转化大肠埃希菌JM109,经IPTG诱导后,目的蛋白表达率约为25%;SDS-PAGE、Western blotting初步测定目的蛋白的相对分子质量约为28 500,与理论预期值一致。结论:pQE-EGFP重组质粒的成功构建、表达和鉴定为TAT-EGFP融合蛋白穿透细胞能力的研究奠定了基础。
- 李欢胡晓梅杨杰饶贤才丛延广黎庶周莹冰朱军民胡福泉
- 关键词：增强型绿色荧光蛋白基因克隆蛋白表达蛋白鉴定
- 毕赤酵母表达肽抗生素hPAB-β的纯化被引量：6
- 2008年
- 目的在成功构建肽抗生素hPAB-β重组毕赤酵母的基础上,深入探讨酵母表达hPAB-β的规模化纯化方法。方法采用高密度发酵法在3.7L发酵罐中对pPIC9K-hPAB-β/GS115优5重组菌株进行发酵,收集发酵液,依次采用W-UF-Ⅱ过滤系统超滤、反相层析、阳离子交换、分子筛层析等纯化技术对目标表达产物逐级进行纯化,目的蛋白用15%的Tricine-SDS-PAGE电泳进行跟踪分析。最终纯化产物的生物学活性用平板琼脂扩散法进行测定。结果在培养至工程菌菌体湿重约200～250g/L时,以甲醇诱导培养基诱导目的蛋白表达,48h后菌体湿重达280g/L,目标产物表达量约75mg/L。发酵液经Mr10000膜超滤,达到去除大部分酵母色素和浓缩样品的目的(体积浓缩约2/3)。再经反相层析、离子交换、分子筛层析纯化,最终目的产物的纯度达98%以上,得率达32.5%。且纯化的目的蛋白具有良好的杀灭金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的活性。结论酵母表达肽抗生素hPAB-β经膜超滤、反相层析、离子交换和分子筛层析四步纯化,实现了去除非目的蛋白、酵母色素及脱盐的目的,为规模化制备hPAB-β创造了前提。
- 陈志瑾丛延广周莹冰侯瑞胡福泉饶贤才
- 关键词：毕赤酵母肽抗生素发酵纯化
- 铜绿假单胞菌噬菌体PaP1内溶素基因克隆、表达及活性分析被引量：5
- 2008年
- 目的构建铜绿假单胞菌噬菌体内溶素重组原核表达载体,检测重组蛋白的酶学活性及抑菌活性。方法利用重组技术将铜绿假单胞菌裂解性噬菌体PaP1内溶素基因构建到表达载体pQE31中,并在大肠杆菌M15(pREP4)中诱导表达,通过非变性方法纯化重组融合蛋白,利用酶谱电泳、抑菌实验等技术检测酶学活性及抑菌活性。结果酶谱电泳方法结果显示重组融合蛋白对铜绿假单胞菌细胞壁肽聚糖有降解作用,抑菌活性检测结果显示重组融合蛋白对金黄色葡萄球菌有一定的抑菌效果。结论该研究从实验方面证实了噬菌体PaP1内溶素基因的生物学功能。
- 孙卫忠胡晓梅饶贤才谭银玲陈志谨丛延广胡福泉
- 关键词：噬菌体基因表达活性鉴定
- 革兰阴性菌基因敲除载体的构建及其应用被引量：11
- 2009年
- 目的构建1个适用于革兰阴性菌的精确基因敲除载体并证明其有效性。方法构建的载体主要包括以下成分:π蛋白依赖性复制起点oriR6K;接合转移基因mob,使载体可以通过简单的接合方式实现转移;多克隆位点序列:EcoRⅠ-XbaⅠ-ApaⅠ-SfiⅠ-SacⅠ-NotⅠ-SpeⅠ-NdeⅠ-SacⅡ-BglⅡ;反向选择标志SacB;正向选择标志卡那霉素抗性片段。载体构建完成后,采用该载体对弗氏枸橼酸杆菌的yeeZ基因进行框架内敲除,以验证其有效性。结果成功构建了敲除载体,命名为pYG4,并对yeeZ基因进行了框架内精确敲除获得突变株。结论本研究构建的载体适用于对革兰阴性菌进行目的基因的精确敲除,将在细菌基因功能研究中得到广泛的应用。
- 王景穆媛嫒黎庶陈志瑾熊坤丛延广
- 关键词：突变株基因功能
- 嗜酸乳酸杆菌ATCC4356菌株异源二聚体β-半乳糖苷酶的克隆表达被引量：7
- 2008年
- 嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)的异源二聚体β-半乳糖苷酶属于糖苷水解酶2家族,由两个部分重叠、协同翻译的基因编码(lacL和lacM)。【目的】克隆表达该酶并测定其酶学特性。【方法】参照已全基因组测序的嗜酸乳酸杆菌NCFM菌株,以嗜酸乳酸杆菌ATCC4356菌株基因组为模板,将lacL的RBS到lacM的终止子之间的序列(2834bp)克隆到pQE31质粒上,并电转化JM109菌株。以下列步骤纯化表达产物:硫酸铵分级沉淀、阴离子交换、亲和层析和凝胶排阻层析。以凝胶排阻层析测定纯化酶的天然分子量,以邻硝基苯基半乳糖为底物测定其酶学特性。【结果】实现了该酶在JM109菌株中的可溶性表达。其氨基酸序列有一处不同于嗜酸乳酸杆菌NCFM菌株,即其大亚基(LacL)的第512位氨基酸不是组氨酸而是精氨酸。纯化酶比活力为226U/mg蛋白,天然分子量为96.3±4.6kDa,最适pH为7,最适温度为49℃,Km和Vmax值分别是:2.18±0.12mmol/L,273±5U/mg蛋白。
- 潘渠李晋川丛延广刘丽娜朱军民胡福泉
- 关键词：Β-半乳糖苷酶克隆表达纯化KM值
- 酵母表达肽抗生素hPAB-β抗单纯疱疹病毒活性分析
- 肽抗生素(Peptide antibiotics)为生物体基因编码的小肽,通常由12～60个氨基酸残基构成,分子量小于5kDa。它们在动、植物中的广泛分布,提示其在生物体的生长及抗感染中发挥重要作用。虽然发现了一些阴离子...
- 陈志瑾饶贤才丛延广杨杰王冬梅胡珍原薇薇
- 文献传递
- 人膀胱癌细胞波状层次生长的研究被引量：2
- 2000年
- 目的 观察人膀胱癌细胞 (BIU)在体外培养条件下的生长有序行为。方法 将BIU细胞悬液进行局限区域接种 ,待其形成贴壁生长的群落后进行宏观和显微动态观察及参数测量 (扩展直径、扩展速率、细胞形态、细胞平均密度、细胞平均大小、脱氢酶活性、对pH的敏感性等 )。结果 体外细胞培养条件下 ,局限区域生长的BIU细胞群落能出现明显的层次特性 ,不同区域细胞的形态、大小、密度、脱氢酶活性以及对pH的敏感性均存在差异。结论 空间封闭和生物耗散导致细胞自组织 ,其结果表现为生长有序行为。
- 邓国宏丛延广刘俊康徐启旺袁泽涛
- 关键词：膀胱癌生物波肿瘤细胞生长
- 肽抗生素hPAB-β抗金黄色葡萄球菌L型活性分析
- 2010年
- 目的观察毕赤酵母高密度发酵表达的肽抗生素hPAB-β对L型细菌的抗菌活性。方法采用新青Ⅱ纸片扩散法诱导金黄色葡萄球菌标准株ATCC25923L型,通过形态学观察、滤过实验、回复实验以及电镜观察鉴定L型菌;采用酵母高密度发酵制备肽抗生素hPAB-β,通过稀释法检测hPAB-β对L型细菌的抗菌活性并测定其最小抑菌浓度(MIC)。结果用新青Ⅱ可成功诱导金黄色葡萄球菌L型;所得L型菌能通过0.45μm的滤膜;撤去抗生素后,L型能回复为野生菌;电镜下见多数金葡菌L型的细胞壁部分缺失,少数完全缺失;稀释法检测显示hPAB-β对金葡菌L型具有良好的抗菌活性,其MIC值为32μmol/L。结论肽抗生素hPAB-β对金葡菌L型有良好的抗菌活性。
- 王冬梅陈志瑾杨杰丛延广王竞朱军民胡珍原薇薇胡福泉饶贤才
- 关键词：肽抗生素L型菌
- 敲除yncD‑aroC双基因的甲型副伤寒沙门菌减毒疫苗
- 本发明涉及一种敲除yncD‑aroC双基因的甲型副伤寒沙门菌减毒疫苗，所述疫苗包含甲型副伤寒沙门菌yncD‑aroC敲除株，该敲除株是通过甲型副伤寒沙门菌yncD基因敲除载体敲除yncD基因以及通过甲型副伤寒沙门菌aro...
- 丛延广熊坤陈志瑾饶贤才李建华朱春岳
- 文献传递
