刘彩红
- 作品数：7 被引量：3H指数：1
- 供职机构：哈尔滨医科大学大庆校区医学检验与技术学院更多>>
- 发文基金：辽宁省自然科学基金辽宁省教育厅高校重点实验室项目辽宁省高校科研计划项目更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- hβ-arrestin1重组蛋白不同亚型筛选及互作鉴定
- 2012年
- 目的构建GST/β-arrestin1融合蛋白表达载体,筛选其不同亚型重组子,并诱导表达、纯化蛋白,初步进行蛋白亚型互作比较,为进一步功能研究提供实验基础。方法提取人源细胞的mRNA,反转录为cDNA。用PCR法扩增hβ-arrestin1全长编码基因,通过SalI和NotI酶切位点将hβ-arrestin1全长定向插入pGEX-5X-1中,构建原核表达载体pGEX-5X-1-β-arrestin1,并通过BglⅡ单酶切筛选A、B亚型,然后将重组质粒转入E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,用谷胱甘肽-琼脂糖珠亲和纯化表达的GST/β-arrestin1A、B,SDS-PAGE鉴定,互作实验比较亚型的结合能力。结果酶切及测序结果证明,成功构建了β-arrestin1A、B原核表达载体,并通过SDS-PAGE证实:经IPTG诱导表达及亲和纯化,从转化重组质粒的BL21菌株中获得了融合蛋白GST/β-arrestin1A、B亚型,通过GST Pulldown初步比较了重组β-arrestin1A、B蛋白亚型的结合能力。结论成功构建pGEX-5X-1-β-arrestin1A、B原核表达载体并确定了融合蛋白的诱导表达及纯化方法,且互作实验显示β-arrestin1A有较强的结合能力,为进一步研究β-arrestin1的生物学功能奠定了基础。
- 刘彩红王利利冯艳玲朱亚勤
- 关键词：克隆
- 高GC hTwist融合蛋白载体构建及其表达条件优化被引量：2
- 2012年
- 目的构建高GC基因Twist融合蛋白表达载体;高效表达并纯化GST/TWIST融合蛋白,为GST-Pulldown等实验做准备。从而进一步研究其生物学功能。方法以胃癌细胞系SGM7901 cDNA为模板,依据高GC含量基因Twist分子结构特点和高GC含量基因引物设计策略,合成PCR引物。本实验通过分析各种DNA聚合酶不同扩增效率及特异性,选择适合高GC基因扩增的DNA聚合酶,优化反应体系的离子强度,并且结合改良降落PCR等综合策略的实施,比较不同策略下高GC含量基因Twist PCR产物的特异性及效率,尝试高效扩增特异的高GC含量Twist全长编码基因,通过Bam HI和Xho I双酶切位点将Twist全长定向插入pGEX-5X-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-Twist,并转化E.coli DH5α,筛选富含GC的Twist阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测序正确后,转化E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,经谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化表达产物,SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果通过Platinum pfx DNA聚合酶配合PCRx加强缓冲液的使用及改良降落PCR策略的实施,独立可重复实验证实:我们获得了高效特异的高GC Twist全长编码基因,成功构建原核表达质粒pGEX-5X-1-Twist。诱导表达的GST融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定,检测到分子量正确的特异性蛋白条带,经纯化,得到高纯度的融合蛋白。结论上述策略的实施可以成功完成高GC Twist原核表达载体的构建,并确定GST/TWIST融合蛋白表达的最适条件,获得了高纯度融合蛋白,为进一步研究TWIST蛋白的生物学功能奠定基础。
- 王利利刘彩红朱亚勤
- 关键词：克隆融合蛋白原核表达
- 人源MAP3K7克隆及其GST融合蛋白的表达和鉴定被引量：1
- 2011年
- 目的构建MAP3K7蛋白GST的融合表达载体,高效表达和纯化GST-MAP3K7融合蛋白,为GST Pulldown实验做准备。方法通过PCR扩增MAP3K7全长编码基因,经双酶切定向克隆至表达载体pGEX-5X-1,构建原核重组表达载体pGEX-5X-1-MAP3K7,通过酶切和测序鉴定后,导入E.coli BL21宿主菌中,IPTG诱导表达融合蛋白,经谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化表达产物,SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。结果经测序鉴定成功构建了原核重组表达载体pGEX-5X-1-MAP3K7,诱导后的GST融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot检测到分子量正确的特异性蛋白条带,经纯化后,得到了高纯度的融合蛋白。结论成功构建了MAP3K7全长的GST重组表达载体,确定了GST-MAP3K7融合蛋白表达的最佳条件,诱导成功并得到了高纯度的融合蛋白,为进一步研究MAP3K7蛋白的生物学功能奠定了基础。
- 冯艳玲刘彩红朱亚勤
- 关键词：基因克隆融合蛋白原核表达
- hβ-arrestin2基因重组质粒构建及蛋白表达和定位
- 2015年
- 目的:构建p EGFP-C1-β-arrestin2融合蛋白表达载体,并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法:以p GEX-5X-1-β-arrestin2为模板,PCR法扩增hβ-arrestin2编码序列,亚克隆至p EGFP-C1中,p EGFP-C1-β-arrestin2经双酶切初步鉴定再送测序公司检测正确后瞬时转染人胚肾细胞HEK293,Western blot检测融合蛋白表达。激光扫描共聚焦显微镜观察融合蛋白在HEK293细胞中的分布。结果:hβ-arrestin2编码序列被成功克隆至p EGFP-C1中,Western blot检测到融合蛋白表达,分子量约为77k Da,p EGFP-C1-β-arrestin2定位于HEK293细胞的细胞质中。结论:成功构建hβ-arrestin2基因真核表达载体,证实了融合蛋白定位在HEK293的细胞质中。
- 刘彩红毛琪郭文东朱亚勤
- 关键词：绿色荧光蛋白
- Twist介导的TFF3瞬时激活NFκB炎性应答上游信号机制
- NFκB是炎症应答的重要转录调节因子。在炎性细胞中,多以p65/p50二聚体参与炎性介质诱导的炎症应答,如细胞因子分泌、凋亡。但肠上皮(IEC)中NFκB是如何发挥它的免疫炎性应答调节作用,尚不明确。IEC作为重要的免疫...
- 郭文东冯艳玲刘彩红王利利朱亚勤
- 关键词：TFF3
- 文献传递
- TFF3-Twist-p65炎症应答信号调节的上游分子机制初探
- 肠三叶因子3(TrefoilFactor3,TFF3)是三叶因子家族的成员,主要分布于杯状细胞,并在上丘脑发现其表达。研究表明,TFF3除作为粘膜保护肽,对上皮组织起到损伤修复作用外,最近发现它具有抗凋亡活性;临床研究发...
- 郑倩倩刘彩红郭文东冯艳玲朱亚勤
- 关键词：TFF3TWISTP65炎症应答
- 文献传递
- 人FGFR4基因重组质粒的构建及融合蛋白的表达
- 2015年
- 目的探讨成纤维细胞生长因子4(FGFR4)重组质粒的构建方法,并检测FGFR4融合蛋白的表达。方法从Hep G2细胞中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增FGFR4的全长编码序列,双酶切后与pc DNA3.1/MycHis A载体连接,构建pc DNA3.1/Myc-His A-FGFR4重组质粒。重组质粒经双酶切和测序鉴定后瞬时转染人胚肾HEK293细胞,采用Western blot法检测FGFR4融合蛋白的表达。结果 FGFR4编码序列被成功克隆至pc DNA3.1/Myc-His A质粒中,成功构建了pc DNA3.1/Myc-His A-FGFR4载体。转染HEK293细胞后检测到FGFR4融合蛋白的稳定表达,分子量约为89 k D。结论成功构建了FGFR4全长编码基因重组质粒,并检测到转染后FGFR4蛋白在HEK293细胞中的表达。
- 刘彩红张婷婷纪书婷
- 关键词：质粒转染
