王俊 作品数:16 被引量:38 H指数:5 供职机构: 北京农学院动物科学技术学院 更多>> 发文基金: 北京市属高等学校高层次人才引进与培养计划 国家自然科学基金 更多>> 相关领域: 农业科学 更多>>
伪狂犬病病毒野毒感染快速检测方法的比较 引言猪的伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(PRV)引起的一种严重危害养猪业的传染病,接种PRV-gE基因缺失疫苗和淘汰PRV野毒感染猪是防控该病的主要手段.可用于PRV野毒感染的快速检测方法主要有抗体检测与PCR技术,活体检测组... 王俊 李雪明 周双海猪细环病毒1型衣壳蛋白的原核表达 以猪细环病毒1型ORF1全长质粒为模板,克隆衣壳蛋白部分基因,并转化至原核表达载体pET-32a中,构建重组原核表达载体pET-32a-Cap,转入大肠埃希菌Rosetta(DE3)中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE... 王俊 周双海伪狂犬病病毒gE基因荧光定量PCR检测方法的建立 被引量:5 2015年 伪狂犬病病毒(PRV)野毒有gE基因,而其疫苗毒株无gE基因,这为检测有无PRV野毒感染提供参考。用PCR方法扩增PRV的gE基因片段,构建含有PRV gE基因片段的重组质粒。以系列稀释后的重组质粒作为模板,应用SYBR GreenⅠ来进行检测PRV gE基因的实时荧光定量PCR扩增。结果显示:在(6.9×107~6.9×101)copies/μL范围内,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物具有单一整齐的熔解曲线峰,标准曲线具有优良的线性关系。该方法最低可准确检测69copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于2%,对PRV-gE基因缺失疫苗毒株和常见猪源DNA病毒的检测结果均为阴性,对临床样品的检出率高于常规PCR方法。研究结果表明,建立了1种特异性强、灵敏度高、重复性好的检测PRV gE基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,可用于PRV野毒感染的定量检测。 李雪明 于红欣 杨红杰 王俊 王俊关键词:伪狂犬病病毒 GE基因 荧光定量PCR 猪细环病毒1型衣壳蛋白的原核表达及鉴定 被引量:1 2015年 为了制备猪细环病毒1型(TTSuV1)抗体,并为建立TTSuV1免疫学检测方法奠定基础。用PCR技术扩增TTSuV1衣壳蛋白(Cap)基因片段,与载体pET-32a定向连接,构建重组原核表达质粒pET-32a-Cap,转化入大肠杆菌Rosetta(DE3),诱导重组阳性菌表达,SDS-PAGE研究融合蛋白表达情况。对重组融合蛋白进行纯化、复性后,免疫BALB/c小鼠4次来制备鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体。分别以鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体和TTSuV1猪阳性血清为一抗,对重组融合蛋白进行免疫印迹检测。结果显示,成功表达了TTSuV1Cap截短体融合蛋白,表达产物以包涵体形式存在,重组蛋白可与鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体及TTSuV1猪阳性血清发生特异性结合,表明表达的TTSuV1-Cap融合蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。 王俊 陈丙生 杨倩 于红欣 刘芊麟 周双海关键词:衣壳蛋白 原核表达 猪细环病毒1型实时定量PCR检测方法的建立 为定量检测猪细环病毒1型(TTSuV1),建立了检测TTSuV1核酸的SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法。构建含有TTSuV1基因249bp片段的重组质粒,用该重组质粒进行SYBR GreenⅠreal-time ... 王俊 单晶晶 孟凡伟 周双海 黎阳关键词:实时定量PCR 文献传递 伪狂犬病病毒gE基因荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用 为建立一种快速检测伪狂犬病病毒(PRV)野毒的荧光定量PCR方法.根据PRV-gE基因序列设计1对特异性引物,构建含有PRV-gE基因片段的重组质粒,以系列稀释后的重组质粒作为模板来建立定量检测PRV-gE的SYBR G... 于红欣 李雪明 杨红杰 王俊 周双海关键词:伪狂犬病病毒 GE基因 荧光定量聚合酶链反应 文献传递 猪流行性腹泻病毒Real-timePCR检测方法的建立 被引量:6 2014年 为定量检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)载量,建立PEDV的Real-time PCR方法。用RT-PCR方法扩增PEDV的M基因片段,构建含有M基因片段的重组质粒,用该重组质粒进行SYBR Green I Real-time PCR,来建立检测PEDV的荧光定量PCR方法。结果显示:在(5.56×102~5.56×107)拷贝/μL范围内,所建立方法具有优良的线性关系,其决定系数为0.9996,扩增效率为99.5%,扩增产物的熔解曲线只有一个特异性峰,无引物二聚体峰,熔解温度为(81.18±0.21)℃。该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒II型等猪源病毒均检测不到扩增产物,重复性试验的变异系数小于3%,对临床样品的检出率高于常规PCR方法。研究结果表明:建立的Real-time PCR检测方法特异性强、重复性好、灵敏性高,可用于PEDV的定量检测及其早期感染的快速诊断。 孟凡伟 张雪 王俊 单晶晶 王鹏 周双海 王志军关键词:猪流行性腹泻病毒 SYBR I REAL-TIME PCR 猪细环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量:5 2014年 根据猪细环病毒2型(TTSuV2)基因非编码区保守序列设计了1对特异性引物,构建含有TTSuV2基因片段的重组质粒,以系列稀释后的重组质粒作为模板来建立定量检测TTSuV2的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法。结果显示,该方法的标准曲线的决定系数达0.999,显示出优良的线性关系;最低可检测50copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于3%;用该方法对TTSuV1、猪圆环病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒及猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测结果均为阴性;对临床样品的检出率高于常规PCR方法的检出率。结果表明,建立的real-time PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于TTSuV2的检测与定量分析。 单晶晶 王俊 孟凡伟 于红欣 周双海关键词:PCR SYBR 猪圆环病毒Ⅱ型ORF4真核表达载体构建及其抗体制备 被引量:1 2014年 为构建猪圆环病毒II型(PCV2)ORF4基因的真核表达载体,并制备ORF4抗体。用PCR方法扩增PCV2 ORF4基因,将其克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+)或pEGFP-C1,成功构建出重组质粒pCDNA-ORF4、pEGFP-ORF4。重组质粒pEGFP-ORF4转染PK15细胞后,pEGFP-ORF4蛋白在细胞中明显表达,荧光信号主要定位于细胞核内。重组质粒pCDNA-ORF4接种BALB/c小鼠后,接种小鼠血清能与PCV2发生特异性免疫反应,经4次接种后抗体效价均达到1:26以上,表明诱导产生了PCV2 ORF4抗体。研究结果表明,构建了2种PCV2 ORF4真核表达载体,并制备了PCV2 ORF4抗体,为PCV2ORF4基因功能研究奠定了基础。 孟凡伟 王俊 单晶晶 周双海 李雅慧 高晓波关键词:猪圆环病毒II型 真核表达载体 猪圆环病毒1型real-time PCR检测方法的建立 被引量:6 2014年 为了建立一种定量检测猪圆环病毒1型(PCV1)的实时荧光定量PCR方法,根据PCV1基因序列设计了1对特异性引物,并构建含有PCV1基因片段的重组质粒,以系列稀释后的重组质粒作为模板建立了定量检测PCV1的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法,并绘制标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法的标准曲线的决定系数为0.999,显示出优良的线性关系;最低可准确检测320copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于2%;该方法对PCV2、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒等的检测结果均为阴性;对临床样品的检出率高于常规PCR方法。结果表明,建立的real-time PCR特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于PCV1的检测与定量分析。 于红欣 王立娇 孟凡伟 王俊 周双海关键词:猪圆环病毒1型 SYBR REAL-TIME PCR